子宫颈鳞癌细胞外泌体介导miR-221-3p调节血管生成的作用机制研究

发布时间：2020-05-27 15:05

【摘要】：宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌。近年来,宫颈筛查的普及让大部分宫颈癌及癌前病变得到“早发现早治疗”,早期宫颈癌的治疗效果及预后良好。但是,对于晚期或复发的宫颈癌患者,目前仍然没有良好的治疗方案和对策。血管生成是肿瘤进展的关键环节,最近研究表明,血管生成可能成为晚期宫颈癌治疗的新靶点。目前,对于复发、晚期及转移的宫颈癌,应用比伐珠单抗(bevacizumab)辅助化疗可改善其整体存活期中位数。但是,在没有明确靶点的情况下非选择性地使用抗血管联合治疗的临床疗效因其副作用、不良反应及费用过高而大打折扣。因此,进一步探索和开发新的抗血管治疗靶点或预测靶点对药物开发具有重要意义。肿瘤微环境中血管生成作为肿瘤发生发展和转移的基础,是恶性肿瘤进展的关键步骤之一。外泌体是细胞通过胞吐作用分泌到细胞外环境中并可通过多种途径介导细胞间物质与信息传递的囊泡小体,是一种新型的细胞间通讯途径。microRNAs(miRNAs)是细胞内22～25-nt的非转录单链RNA分子,主要在转录后水平调控基因的表达,具有广泛的生物学功能,包括肿瘤血管生成。最新研究表明,肿瘤细胞分泌的外泌体能够作为miRNAs的运载体实现细胞间的传送,从而实现细胞间的信息交流和调控生物学过程。因此,进一步探索外泌体来源miRNAs在肿瘤血管生成中的作用对开发其诊疗的潜在作用具有重要意义。我们前期研究发现,miR-221-3p在宫颈鳞状细胞癌中高表达,并且miR-221-3p的表达水平与肿瘤血管密度相关。但是miR-221-3p在宫颈癌的血管生成中的作用机制甚未明确,需要进一步的探索和研究。因此,本课题将研究外泌体在miR-221-3p调控宫颈鳞癌血管生成中的作用及其在宫颈癌临床诊治中的潜在应用,研究内容分为四个部分:第一,miR-221-3p在宫颈癌中的表达及其与血管密度的关系。通过原位杂交检测临床宫颈癌组织标本中miR-221-3p的表达;IHC检测CD31评估血管密度,分析miR-221-3p的表达与血管密度的相关性。结果提示miR-221-3p的表达水平与血管密度的高低呈正相关,表明miR-221-3p可能对血管生成具有促进作用。第二,外泌体介导miR-221-3p调控血管生成的作用。通过体外提取宫颈鳞状细胞癌的外泌体,电镜和WesternBlot对外泌体的性质进行鉴定;荧光显微镜观察发现外泌体能够将miR-221-3p转运进入HUVECs;富含miR-221-3p的外泌体对HUVECs的迁移能力具有促进作用,对HUVECs体外Matrigel成管和3D出芽的能力均具有明显促进作用。第三,外泌体介导miR-221-3p调控血管生成和肿瘤生长的作用。通过免疫缺陷小鼠皮下瘤模型及肿瘤内注射外泌体实验观察外泌体介导miR-221-3p对肿瘤血管生成及肿瘤生长的影响;IHC标记肿瘤内和肿瘤周边的微小血管。发现miR-221-3p明显促进血管新生并促进肿瘤的生长。第四,miR-221-3p调控血管生成的作用机制。通过生物信息学方法预测PDCD1O可能是miR-221-3p的下游靶点;miRanda数据库分析发现PDCD10与miR-221-3p存在碱基互补位点;双荧光素酶报告基因试验证实,miR-221-3p与PDCD1O mRNA特异性结合;miR-221-3p在HUVECs中下调PDCD10的表达。综上,宫颈鳞状细胞癌通过分泌外泌体转运miR-221-3p进入血管内皮细胞,并下调PDCD10的表达水平,从而促进血管的生成和促进肿瘤的进展。
【图文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋ｌ．ｌ邋Ｈ－ｓｃｏｒｅ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆｍｉＲ－２２１－３ｐ邋ｉｎ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑１．２．２邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宫颈及宫颈癌中的表达情况逡逑根据Ｈ－ｓｃｏｒｅ评分，统计结果显示（图１－２），与正常宫颈组织相比，ｍｉＲ－２２１－３ｐ逡逑在宫颈鳞状细胞癌中年表达水平相对较高（正常宫颈３０．２７±４．０３６邋ｖｓ宫颈癌逡逑１４８．６士９．８０８．邋Ｐ＜邋０．０００１）。结果提示，ｍｉＲ－２２１－３ｐ可能与宫颈癌的进展有关。逡逑Ａ邋Ｎｏｒｍａｌ邋Ｃｅｒｖｉｘ逦ＣＳＣＣ逦Ｂ邋ａ逦逦逦逡逑－＇＇ｍ逦ｉｏ逡逑图１－２．邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宫颈及宫颈癌中的表达ａ）原位杂交结果，ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宫逡逑颈和宫颈淲状细胞癌中的表达的典型图片（光学显微镜２００ｘ）；邋ｂ）邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ在正常宫颈逡逑及宫颈癌中的表达（＊＊Ｐ＜邋０．０００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２２１－３ｐ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｒｖｉｘ邋ａｎｄ邋ＣＳＣＣ．邋ａ）邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ逡逑ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ｉｎ邋ｓｉｔｕ邋ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲ２２１－３ｐ邋ｉｎ邋１５邋ｎｏｒｍａｌ邋ｃｅｒｖｉｘ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ逡逑４５邋ｓｑｕａｍｏｕｓ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｓａｍｐｌｅｓ．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｔ邋ｘ２００逡逑ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ

通过电镜和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ的方法对所提取的外泌进行鉴定。结果提不，，透逡逑射电子显微镜下观察两者形态均表现为典型外泌体结构，即直径位于４０？ｌＯＯｎｍ逡逑之间，有完整双层脂膜包被的杯口状的囊泡样结构（图２－１Ａ）；蛋白印迹法检测逡逑显不Ｓｉｈａ－Ｅｘｏ和Ｃ３３ａ－Ｅｘｏ均表达外泌体表面标志物ＣＩ）６３和ＣＩ）８１，形态学和逡逑分子水平证实了所提取囊泡为外泌体（图２－１Ｂ）。逡逑Ａ逦Ｓｉｈａ－Ｅｘｏ逦Ｃ３３ａ－Ｅｘｏ逦Ｂ邋Ｓｉｈａ－Ｅｘｏ邋Ｃ３３ａ－Ｅｘｏ逡逑Ｈ——卜逡逑＇＇ａＫｋ邋？邋ＣＤ８１１—邋—２６ＫＤａ逡逑ＧＡｐｐＨｉ邋ｉｍｗｈｉｉｉｉ邋３７Ｋｐａ逡逑图２－１．宫颈癌细胞系培养基的外泌体的提取与鉴定ａ）电镜观察ＳｉｈａａｎｄＣ３３ａ细胞系外泌逡逑体的形态（标尺＝５０邋ｎｍ）；邋ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测外泌体的标记蛋白ＣＤ６３和ＣＤ８１，ＧＡＰＤＨ逡逑作为内参照。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｌ＇ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｃｅｌｌ－ｓｅｃｒｅｃｔｅｄ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．邋（ａ）逡逑２７逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 黄东宁;赵红珊;;PDCD10,一个新的多功能信号转导调节分子[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年04期

本文编号：2683710