GDF-9和AMH对排卵障碍及卵子发育的调控研究

发布时间：2020-06-05 21:03

【摘要】：研究背景:中国不孕不育发病率约占育龄人群的10%至12%,其中女方因素中的30%是由排卵障碍引起的。卵子发育是在女性的卵巢中以卵泡的形式进行,在发育过程中受着激素与生长因子的调节,当发育成熟出现异常时会出现不同形式的排卵障碍。TGF-β家族是在卵母细胞成熟中重要的调节因子,研究发现卵子的成熟同其周围的颗粒细胞密切相关。GDF-9和AMH同属于TGF-β家族,不仅在卵母细胞成熟中发挥重要的作用,而且在不孕不育症的治疗与诊断等临床方面具有重要的指标特征。本论文以GDF9和AMH为研究对象,对其在排卵障碍患者临床应用进行评价分析,并且对GDF9在哺乳动物卵母细胞体外培养成熟体系的应用进行了探索,通过对排卵障碍病例的转录组进行分析,进一步揭示GDF9和AMH在卵泡的生长发育中起到的作用。第一部分生长分化因子9(GDF-9)对卵巢功能的评价应用目的:1对内蒙古医科大学附属医院进行ICSI女性患者的颗粒细胞GDF9表达进行定量分析,同患者对超排激素(主要为FSH)的敏感度进行协同分析,以期找出二者之间的关联关系。2以小鼠为实验对象,在小鼠的IVM中添加GDF9与FSH来观察对小鼠卵母细胞成熟及胚胎发育的影响,为今后GDF9在人类的卵母细胞体外培养体系的应用进行理论探索。方法:1选取2017年1月到2018年1月就诊于我院行卵胞浆内单精子注射的女性患者72例,依据取卵时获得平均直径14 mm的卵泡数目进行分组:卵泡数≤5个为卵巢低反应组,6～19个为中反应组,≥20个为高反应组,各24例。观察卵巢不同反应组颗粒细胞GDF-9基因表达情况,以及GDF-9表达与排卵障碍的相关性。2将超排获得的小鼠卵母细胞分别培养在M199、M199+FSH+GDF9、M199+FSH、M199+GDF9中体外成熟成熟24h小时后,体外受精并统计卵裂率与囊胚率。结果:1.72例IVF患者中卵巢低反应组24例,中反应组24例,高反应组24例;各组患者的年龄、不孕年限、基础FSH、E2水平、Gn用量比较差异均无统计学意义(P0.05)。2.在患者卵泡壁颗粒细胞及卵丘颗粒细胞中均有GDF-9mRNA表达,3组比较差异有统计学意义(P0.05)。低反应组卵泡壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞的GDF-9mRNA相对表达量均低于中反应组及高反应组(均P0.05)。3.卵巢低、中、高反应组的获卵数分别为:(3.45±0.97)、(12.38±3.36)、(24.38±4.86)个。卵泡壁颗粒细胞、卵丘颗粒细胞GDF-9mRNA表达量与超排卵获卵数呈正相关。4无论是单独添加FSH、GDF9,还是协同添加FSH、GDF9,对于胚胎的卵裂率与囊胚率都极大的提升且差异显著(P0.05)。外源性FSH和GDF9对卵母细胞的体外成熟都有着促进作用,并且这种促进作用对卵母细胞的成熟率差异不明显(85.6%、81.5%)。单独FSH、GDF9实验组二者之间的囊胚率无显著差异,单独添加同协同添加实验组对比差异显著(P0.05)。结论:结果表明人类卵泡发育阶段颗粒细胞与卵丘细胞也存在GDF9的表达,说明卵泡在发育阶段不仅存在卵子通过旁分泌方式分泌可溶性分子调节卵泡的发育,而且也存在颗粒细胞与卵丘细胞通过自分泌的形式调节卵泡的发育。不同患者的颗粒细胞GDF9表达的量同患者对外源FSH刺激的敏感度成正比。分析因为GDF9的表达调控同FSH保持一致,因此当患者体内的GDF9表达量较高时,FSH的受体表达量也到了高点,此时患者对外源的FSH也可以起到最大的促进卵泡发育的作用。因此,利用GDF浓度可以作为超排效果的前期评价指标之一,可以合理的调整患者的超排与取卵方案,不仅可以节省试管婴儿的操作流程,也可以为患者节省治疗费用。体外成熟体系中单独添加FSH、GDF9或协同添加均可以支持胚胎的进一步发育且胚胎发育质量(即卵母细胞成熟质量)较好,FSH、GDF9对卵母细胞成熟的作用存在协同作用。第二部分抗缪勒管激素(AMH)与排卵障碍及IVF妊娠结局的相关性目的:AMH同多囊卵巢综合症(PCOS)和多囊卵巢形态(PCOM)之间有密切的关系,患者的AMH的表达量明显高于正常患者。因此,本论文这部分对排卵障碍患者的AMH及各项生理指标进行了关联分析,并偶联IVF-ET结果对胚胎质量进行评测。方法:酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗缪勒管激素水平,雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH),促黄体激素(LH)、孕酮(P)和睾酮(T)在106名鹿特丹标准诊断为多囊卵巢综合征的不孕妇女(观察组)与102名妇女怀孕前身体检查(对照组)的数据进行比较进行了统计分析。2016年12月至2017年12月因排卵障碍初次行IVF的患者50例,分别统计低获卵组、中获卵组、高获卵组的AMH血清水平,FSH、Gn用量及获胚数与妊娠率的差异。结果:观察组血清中AMH、LH的激素水平均高于对照组(P0.05)。观察组的FSH水平明显低于对照组(P0.05)。Pearson相关分析显示血清AMH与LH(P0.05)及T、FSH(P0.05)呈正相关关系。血清AMH与E2水平无明显关系。IVF中的低获卵数组、正常获卵数组和高获卵数组之间的AMH之间有统计学差异。IVF中的低获卵数组低获卵数的FSH值、Gn的用量显著高于正常获卵数组、高获卵数组,获胚数及临床妊娠率低于正常获卵数组、高获卵数组(P0.05)。结论:AMH浓度与PCOS之间存在显著的相关性,AMH可以作为评价卵巢反应性的指标之一,在临床上可以指导医生用促排激素的用量。不孕患者体内AMH浓度较低时,异常的AMH表达影响卵母细胞成熟质量会影响胚胎的发育及着床。第三部分IVF中异常受精卵GCs细胞的GDF9和AMH基因的转录表达分析目的:排卵障碍患者经超排处理后获得的卵母细胞成熟度不均一,分别收集经IVF后受精正常卵的颗粒细胞和异常受精卵的颗粒细胞进行转录组测序分析,从而找出二者之间GDF9和AMH表达的差异及相关基因的关联。方法:分别收集卵母细胞的卵丘细胞并编号保存,体外受精16小时后观察受精卵情况,将2PN和(?)3PN的卵丘细胞样本送北京诺和致源科技有限公司进行转录组测序。结果:经检测本次数据质量可靠,经过滤后最终正常受精卵的颗粒细胞转录组数据为13.18G,异常受精卵的颗粒细胞转录组数据为10.5G。异常受精卵母细胞相比正常受精卵母细胞发生上调的基因数为693个,下调的基因数为857个。GO富集分析显示异常受精卵的颗粒细胞转录水平发生明显的降低,同时细胞处于应激状态,AMH的表达发生显著的下调。KEGG富集分析后发现TGF-β信号通路在异常受精卵的颗粒细胞生物学作用被抑制,最终导致卵母细胞发育异常而多精受精。
【图文】：

富集,过程,未折叠蛋白,内稳态

图－Ｉ＾一邋ＡＮＧＣｖｓＮＧＣ上调差异基因的ＧＯ富集ＤＡＧ图逡逑从上调差异基因的ＤＡＧ图来看，生物过程的上调基因在ＡＮＧＣ上表现为当逡逑细胞出现异常或内稳态被打破时，其应对压力会出现更多的未折叠蛋白及这些蛋逡逑白在细胞内的反应。细胞组分的上调基因则集中于内质网膜内的一种伴侣蛋白合逡逑
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.8

【参考文献】