sFRP5介导的Wnt信号通路在子痫前期发病中的分子机制和实验研究
发布时间：2020-06-08 13:53
【摘要】：目的:子痫前期(PE)是一种严重的妊娠并发症,绒毛外滋养细胞(EVT)侵袭和螺旋动脉重构异常是其发病的关键所在。s FRP5作为Wnt信号通路的负调控因子,其在滋养细胞侵袭、血管生成等过程中的作用机制还未清楚。本课题旨在检测sFRP5在正常妊娠期血清、子痫前期血清中的表达差异;研究sFRP5对于滋养细胞以及脐静脉内皮细胞的功能学变化(如侵袭、迁移等)的作用并进一步深入其产生机理;探讨s FRP5在子痫前期中可能的分子层面的改变与变化机制。方法:选取在重庆医科大学附属第一医院产科进行剖宫产足月分娩的正常孕妇术前血清15例以及子痫前期孕妇术前血清15例,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测各组血清中s FRP5蛋白分泌水平;通过慢病毒转染进行基因的过表达,使绒毛外滋养细胞HTR8/svneo和人类脐静脉内皮细胞HUVEC中sFRP5基因表达升高;使用流式细胞技术、荧光显微技术以及Western blotting测试其过表达效率;对Wnt/β-catenin信号通路使用其激活剂LiCl增加信号通路的激活程度;采用cck8实验检测细胞增殖;transwell小室和Matrigel侵袭实验检测HTR8/svneo细胞的侵袭性;划痕实验检测HUVEC细胞迁移性;采用蛋白印记技术验证sFRP5与β-catenin等通路蛋白表达量之间的关系。结果:酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果显示,s FRP5蛋白在子痫前期(PE)组血清中表达明显高于对照组血清;sFRP5过表达后细胞慢病毒转染效率可达95%以上,蛋白印记显示过表达后sFRP5表达量升高,证明过表达有效;cck8检测Li Cl在20μM浓度下,对两种细胞作用24h,明显促进细胞增殖;Transwell侵袭实验结果显示,过表达后HTR8/svneo细胞显著降低了其侵袭能力,分别用LiCl处理24h后,可见过表达组和对照组细胞侵袭性有所升高;划痕实验显示过表达后HUVEC细胞迁移能力明显下降,而分别用LiCl处理24h后,可见过表达组和对照组细胞迁移性较处理前有所升高;Western blotting技术检测可发现过表达sFRP5后,β-catenin,p-GSK3β皆表达下降,使用LiCl处理24小时后,两种表达量皆有所升高。结论:sFRP5抑制滋养细胞、内皮细胞的侵袭、迁移能力,其抑制作用可能通过Wnt/β-catenin信号通路介导,并进一步参与子痫前期的发生与发展。
【图文】：
重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2 sFRP5 过表达转染慢病毒转染 HTR8/SVneo 细胞及 HUVEC 细胞成功2.2.1 荧光显微镜检测 sFRP5 过表达慢病毒转染 HTR8/SVneo 细胞和 HUVEC 细胞的效率滴度为 1*108TU/ml 的慢病毒转染 HTR8/SVneo 细胞的 MOI 值为 40-50，HUVEC 细胞株的 MOI 值为 10-20，转染 72 小时后，在荧光显微镜下观察，可见绿色荧光且细胞生长良好。转染了 sFRP5 过表达的慢病毒的细胞株在经过嘌呤霉素筛选后，转染成功的比例可达 90%。（图 2.1）
图 2.2 流式细胞仪检测 HTR8/SVneo 细胞及 HUVEC 细胞绿色荧光（转染效率）A. 阴性对照（未转染慢病毒的 HTR8/SVneo 细胞） B. 过表达 sFRP5 转染慢病毒的 HTR8/SVneo 细胞C.空载体慢病毒的 HTR8/SVneo 细胞 D.阴性对照（未转染慢病毒的 HUVEC 细胞） E.过表达 sFRP转染慢病毒的 HUVEC 细胞 F.空载体慢病毒的 HUVEC 细胞Figure 2.2 Detection of green fluorescence (transfection efficiency) in HTR8/SVneo and HUVEC cells by flocytometryA.Negative controls (HTR8/SVneo cells not transfected with lentiviruses) B. HTR8/SVneo cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 C. HTR8/SVneo cells with empty vectorlentivirus D.Negative controls (HUVEC cells not transfected with lentiviruses) E.HUVEC cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 F. HUVEC cells with empty vector lentiviru2.2.3 蛋白印记法（WB）检测病毒转染后HTR8/SVneo细胞和HUVEC细胞sFRP蛋白的表达HTR8/SVneo 细胞株及 HUVEC 细胞株经过转染慢病毒后，，通过蛋白印记法（WB）检测过表达 sFRP5 组及空载体组两者 sFRP5 蛋白的表达含量，来确定过表达转染的成功。WB 结果显示 sFRP5 过表达后两者 sFRP5 蛋白表达含量显著上
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.244
本文编号：2703183
【图文】：
重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2 sFRP5 过表达转染慢病毒转染 HTR8/SVneo 细胞及 HUVEC 细胞成功2.2.1 荧光显微镜检测 sFRP5 过表达慢病毒转染 HTR8/SVneo 细胞和 HUVEC 细胞的效率滴度为 1*108TU/ml 的慢病毒转染 HTR8/SVneo 细胞的 MOI 值为 40-50，HUVEC 细胞株的 MOI 值为 10-20，转染 72 小时后，在荧光显微镜下观察，可见绿色荧光且细胞生长良好。转染了 sFRP5 过表达的慢病毒的细胞株在经过嘌呤霉素筛选后，转染成功的比例可达 90%。（图 2.1）
图 2.2 流式细胞仪检测 HTR8/SVneo 细胞及 HUVEC 细胞绿色荧光（转染效率）A. 阴性对照（未转染慢病毒的 HTR8/SVneo 细胞） B. 过表达 sFRP5 转染慢病毒的 HTR8/SVneo 细胞C.空载体慢病毒的 HTR8/SVneo 细胞 D.阴性对照（未转染慢病毒的 HUVEC 细胞） E.过表达 sFRP转染慢病毒的 HUVEC 细胞 F.空载体慢病毒的 HUVEC 细胞Figure 2.2 Detection of green fluorescence (transfection efficiency) in HTR8/SVneo and HUVEC cells by flocytometryA.Negative controls (HTR8/SVneo cells not transfected with lentiviruses) B. HTR8/SVneo cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 C. HTR8/SVneo cells with empty vectorlentivirus D.Negative controls (HUVEC cells not transfected with lentiviruses) E.HUVEC cellstransfected with lentiviral vectors expressing sFRP5 F. HUVEC cells with empty vector lentiviru2.2.3 蛋白印记法（WB）检测病毒转染后HTR8/SVneo细胞和HUVEC细胞sFRP蛋白的表达HTR8/SVneo 细胞株及 HUVEC 细胞株经过转染慢病毒后，，通过蛋白印记法（WB）检测过表达 sFRP5 组及空载体组两者 sFRP5 蛋白的表达含量，来确定过表达转染的成功。WB 结果显示 sFRP5 过表达后两者 sFRP5 蛋白表达含量显著上
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.244
【参考文献】
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1 张丽娟;张凤华;汤丽丽;杨伟红;张雪;;妊娠期肝内胆汁淤积症与胎儿损伤[J];中南大学学报(医学版);2013年06期
本文编号：2703183
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