妊娠期母体低T4血症后代注意缺陷多动障碍的研究

发布时间：2020-06-09 06:03

【摘要】：目的妊娠期间低甲状腺素血症,又称妊娠期低T4血症,是指妊娠期间血清游离甲状腺素(maternal free thyroxine,FT4)低于妊娠特异性参考范围下限,而血清促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)水平处于正常范围。由于胎儿的甲状腺于妊娠12周开始发育,于妊娠18至20周左右发挥其功能,此前胎儿发育所需的甲状腺激素均依赖母体供给,因此在大脑发育的关键时期,即使轻度的甲状腺激素减少也会对脑发育造成不利影响。2004年,Vermiglio等人的研究发现碘缺乏地区低T4血症妇女后代注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)发生风险增加,此后人群研究陆续发现妊娠早期母体低T4血症可以造成后代ADHD风险增加。ADHD是儿童及青少年时期最常见的神经发育障碍性疾病之一。全球学龄期儿童及青少年患病率约为5.29%,男女比例约为3:1,甚至更高。甲状腺激素可以影响单胺类神经递质系统发育。多巴胺(DA)是单胺类神经递质的一种。中枢神经递质生成后,储存在囊泡内。当动作电位到达神经末梢时,在钙离子的参与下,以胞吐的方式进入突触间隙,突触间隙的神经递质,一部分发挥生理作用,被突触后膜的受体摄取,另一部分通过多巴胺转运体(DAT)再摄取和单胺氧化酶(MAO)的酶促降解被迅速清除。神经递质的形成以及突触结构的发育均是甲状腺激素作用的靶点。ADHD的发病机制复杂,基础研究显示,ADHD存在多巴胺能神经通路异常,ADHD大鼠、小鼠存在多巴胺转运体(DAT)和多巴胺受体(DAR)异常。突触小体相关蛋白25(SNAP-25)基因作为一种甲状腺反应基因也参与了ADHD的发生。目前低T4血症影响后代发生ADHD的研究局限于人群研究,并无动物实验证实,具体发生机制尚处在争议中。本研究旨在建立碘营养正常的低T4血症大鼠模型,通过多种动物行为学评估方法,观察妊娠期低T4血症是否可以导致后代仔鼠ADHD发生;通过测定仔鼠脑内不同位置多巴胺能神经元受体(DRD1-5)及下游通路各项指标的变化,探讨低T4血症对仔鼠ADHD行为的可能影响因素;同时通过对妊娠早期低T4血症妇女进行Conners问卷调查,观察其后代是否出现多动评分增高的现象,通过临床和动物实验探讨低T4血症对后代ADHD发生的影响。研究方法第一部分1、8周龄wistar雌性大鼠50只适应性喂养一周后,分为正常对照组(n=14),低T4血症组(n=18),甲减组(n=18),特殊饮水喂养9周,检测甲功,并验证成模后,与公鼠合笼。2、通过行为学方法检测后代雄性仔鼠的异常表现。通过延迟强化实验、旷场实验、破除强化实验,评估妊娠期母体低T4血症后代多动症样表现。通过0迷宫实验、Morris水迷宫实验、转棒实验等行为学实验,进一步评估后代仔鼠其他精神障碍,以及空间学习记忆能力、运动能力。3、应用RT-PCR方法检测后代雄性仔鼠脑组织甲状腺激素反应基因SNAP-25以及多巴胺通路指标m RNA的表达。4、应用Western Blot检测多巴胺受体相关通路PI3K/AKT/GSK3β以及c AMP/CREB/AKT通路蛋白水平。5、应用免疫荧光检测仔鼠出生时脑海马及皮层SNAP-25蛋白水平。第二部分1、研究对象来自2011-2014年期间辽宁省沈阳、大连等城市(碘适量地区)在本地居住五年以上,年龄在19-40岁之间的妊娠早期妇女。研究对象均于清晨空腹采血,检测血清TSH、FT4、TPOAb。排除临床甲状腺疾病、双胎妊娠、遗传疾病个人史或家族史以及其他严重慢性疾病史妊娠妇女后,根据本研究组制定的妊娠特异性甲状腺功能诊断标准对其进行筛选和分组,并对人群一般特征进行评估。2、对接受左甲状腺素(LT4)干预的低T4血症妇女,治疗起始剂量为50μg/日,并根据随访甲功调整用药,以保证妊娠期TSH、FT4处于正常范围,最大剂量不超过100μg/日。3、对所有妇女进行随访,填写Conners家长评定量表,对后代5岁左右儿童进行多动评估。比较低T4血症组、LT4干预组与正常对照组问卷评分有无统计学差异。结果第一部分1、低T4血症母鼠成模情况血清TSH及FT4测定结果显示:PTU特殊饮水喂养9周后,与对照组相比,低T4血症组大鼠血清TSH无显著差异,FT4显著降低(p0.05);甲减组大鼠血清TSH显著升高(p0.05),FT4显著降低(p0.05)。2、仔鼠行为学实验评估结果(1)延迟强化(DR)实验中,与对照组相比,低T4血症组后代雄性仔鼠获得大额奖赏明显减少(p0.05),提示低T4血症组雄性仔鼠存在冲动行为。与对照组相比,甲减组后代雄性仔鼠获得大额奖赏明显减少(p0.05),提示甲减组雄性仔鼠存在冲动行为。(2)破除强化实验(EXT)中,与正常对照组相比,低T4组、甲减组雄性仔鼠在破除强化实验的第一天选择更多触碰即时奖赏(反应正确率)(p0.01),较少触碰延迟大额奖赏(p0.01),但触碰屏幕总次数(反应频率)无统计学差异(p0.05),低T4组、甲减组雄性仔鼠反应正确率降低,提示存在持续注意缺陷。低T4组、甲减组雄性仔鼠在EXT的第二天触碰延迟奖赏无明显减少(p0.05),触碰屏幕总次数无统计学差异(p0.05)。(3)旷场实验中,与对照组相比,低T4血症组雄性仔鼠理毛时间明显延长(p0.05),存在活动增多现象。甲减组后代理毛时间较对照组相比无统计学差异(p0.05)。(4)水迷宫实验中,与对照组相比,低T4血症组、甲减组雄性仔鼠逃避潜伏期明显延长(p0.05),提示存在空间学习记忆障碍。与对照组相比,低T4血症组、甲减组仔鼠游泳距离及游泳速度无统计学差异(p0.05)。空间探索实验中,低T4血症组后代雄鼠穿越平台所在象限次数无统计学差异(p0.05),甲减组后代仔鼠穿越平台所在象限次数较对照组明显减少(p0.05)。(5)转棒实验中,与对照组相比,低T4血症组雄性仔鼠平均掉落时间及掉落速度无统计学差异(p0.05),甲减组平均平均掉落时间明显缩短、掉落速度明显降低(p0.05),提示存在运动功能障碍。(6)0迷宫实验中,与对照组相比,低T4血症组、甲减组雄性仔鼠在开臂停留时间无统计学差异(p0.05),无焦虑行为。3、P120天仔鼠体重、大脑重、小脑重、脑重与体重比结果与对照组相比,低T4血症组及甲减组后代雄鼠大脑重、小脑重及体重无明显差异(p0.05),大脑、小脑与体重之比无明显差异(p0.05)。3、P120天雄性仔鼠脑组织RT-PCR结果(1)对仔鼠脑组织海马区域的m RNA进行检测,与对照组相比,低T4血症组SNAP-25 m RNA表达显著升高(p0.05),甲减组SNAP-25 m RNA表达显著升高(p0.05),提示低T4血症组及甲减组存在突触囊泡释放异常。(2)对仔鼠脑前额叶皮质区域的m RNA进行检测,与对照组相比,低T4血症组DRD1及DRD5 m RNA表达显著降低(p0.05),甲减组DRD1及DRD5 m RNA表达显著降低(p0.05)。(3)对仔鼠脑皮质(除外前额叶)区域的m RNA进行检测,与对照组相比,低T4血症组、甲减组SNAP-25 m RNA表达显著降低(p0.05);甲减组MAOA、MAOB m RNA表达显著降低(p0.05),低T4血症组表达无统计学差异(p0.05)(4)对仔鼠脑纹状体区域的m RNA进行检测,与对照组相比,低T4血症组MAOA、MAOB m RNA表达显著降低(p0.05),甲减组表达无统计学差异(p0.05)。(5)对仔鼠小脑区域的m RNA进行检测,与对照组相比,低T4血症组DRD1m RNA表达显著降低(p0.05),甲减组表达无统计学差异(p0.05)。4、P120天雄性仔鼠脑组织Western Blot结果(1)对三组仔鼠脑海马区域进行SNAP-25蛋白水平检测。与对照组相比,低T4血症组海马SNAP-25蛋白水平显著升高(p0.05)。(2)对仔鼠脑前额叶皮质区域进行多巴胺受体通路PI3K/AKT/GSK3β通路以及c AMP/CREB/AKT通路蛋白水平检测。与对照组相比,低T4血症组前额叶皮层PI3K蛋白水平明显升高(p0.05),而其下游各指标无统计学差异(p0.05);甲减组仔鼠各蛋白表达与对照组相比未发现统计学差异(p0.05)。与对照组相比,甲减组仔鼠前额叶CREB蛋白水平显著升高(p0.05),低T4血症组虽有升高,但差异无统计学意义(p0.05)。5、P0天雄性仔鼠脑海马及皮层免疫荧光结果对P0天雄性仔鼠脑组织切片免疫荧光染色,与对照组相比,低T4组及甲减组仔鼠海马SNAP-25荧光强度明显升高,低T4血症组皮层SNAP-25荧光强度明显下降,甲减组皮层SNAP-25荧光强度未观察到显著下降。第二部分1、填写问卷的妊娠早期正常对照组57例,单纯低T4血症组57例,单纯低T4血症LT4干预组32例。比较各组患者一般资料,与对照组相比,妊娠早期低T4组患者、LT4干预组患者BMI、FT4、TSH水平有统计学差异(p0.05),其余基线指标无统计学差异(p0.05)。与低T4血症组相比,LT4干预组患者中等收入人数较多(p0.05),低收入人数较少(p0.05),其余基线水平无统计学差异。2、与正常对照组相比,单纯低T4血症组学习问题评分显著升高(p0.05),多动指数评分显著升高(p0.05)。后代男孩中,与对照组相比,单纯低T4血症组出现多动-冲动评分升高(p0.05),后代女孩各项评分无统计学差异。3、与低T4血症组相比,LT4干预组后代男孩多动-冲动评分得到改善(p0.05),与对照组相比,LT4干预组后代整体学习障碍以及多动指数评分没有改善(p0.05),同时后代整体心身障碍指数评分增加(p0.05)。4、相关分析显示,多动指数与母亲妊娠早期FT4呈负相关(r=-0.236,p0.05),与母亲妊娠早期TSH呈正相关(r=0.191,p0.05);焦虑指数与母亲妊娠早期TSH呈正相关(r=0.187,p0.05);心身障碍评分与母亲妊娠早期BMI呈正相关(r=0.244,p0.05)。结论1、妊娠期低T4血症母鼠后代雄性仔鼠存在ADHD样改变。2、妊娠期低T4血症母鼠后代雄性仔鼠ADHD样改变,可能与母体甲状腺激素缺乏,进而影响子代海马神经元突触囊泡释放、脑皮层多巴胺受体通路指标改变有关。3、与正常对照组相比,妊娠早期低T4血症妇女后代出现学习困难,多动指数升高;后代男孩多动评分升高,而后代女孩没有差异。4、与对照组相比,LT4干预组可以改善后代男孩多动-冲动评分,但没有改善后代整体学习障碍以及多动指数评分,同时增加后代整体心身障碍指数评分。
【图文】：

示意图,平衡木,仔鼠,示意图

步骤：开眼时间从仔鼠出生后第 10 天开始观察，以双眼全部可录三组大鼠整窝仔鼠全部阳性的日期。翻正反射实验在仔鼠出大鼠笼具底部平铺约 5cm 厚度的锯沫垫料，在距离笼具底端 3仔鼠的肩部及跨部使其仰卧，待其停止挣扎后，迅速撤离双手，位。仔鼠能够在空中翻正身体，，以四肢平稳落地则标记为通过；为未通过。通过实验的仔鼠做好标记，第二天不再对其进行测试，将仔鼠放回母鼠身边。用笼中带有母鼠气味的垫料擦拭仔鼠身味改变而拒绝哺乳仔鼠。记录三组大鼠各窝仔鼠全部翻正需要的木实验（balance beam）目的：检测仔鼠精细运动协调能力。步骤：在仔鼠出生后第 21 天脱离哺乳后进行。首先搭建平衡木”字形，宽度逐渐变窄，上层木板最宽处 6.5cm，最窄处 1.7cm；0.5cm，最窄处 5.8cm。搭建好的示意图见图 2。

示意图,示意图,水迷宫,象限

图 5. 转棒实验示意图orris water maze，MWM）orris 水迷宫评估产后 40 天仔鼠空间学习水迷宫由水迷宫装置、图像自动采集系统迷宫宫体由一个直径 120cm 的水池和一。Nodus 软件分析系统可以自动采集动、运动轨迹等参数。水迷宫平均分为四个象限，平台淹没于水登陆），固定于第四象限（平台与池壁、平台位置固定不变。用温度计监控水温过高或过低造成动物应激。实验过程中
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.256;R749.94

【参考文献】