携带凋亡素基因的溶瘤腺病毒ATV对人宫颈癌HeLa细胞的作用研究

发布时间：2020-06-16 17:15

【摘要】：本课题组采用RAPAd.I包装系统,构建了重组腺病毒ATV(Ad-Apoptin-hTERTpE1A)和Ad-MOCK。ATV是由肿瘤特异性启动子(hTERTp,人端粒酶逆转录酶)、启动E1A(病毒复制必需基因)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子、凋亡素基因(Apoptin)及经修饰的腺病毒基因组构成,可选择性杀伤肿瘤细胞,而不破坏正常细胞和组织。因此,ATV是具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤能力的双特异性溶瘤腺病毒。目的:以人宫颈癌细胞(HeLa)为切入点,探讨具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤功能的双特异性溶瘤腺病毒ATV,对HeLa细胞自噬和凋亡的影响,为肿瘤生物治疗提供新的思路及策略。方法:采用WST-1检测ATV对HeLa细胞的抑制作用;Annexin V、Hoechst染色检测ATV诱导HeLa细胞凋亡的能力;PI/RNase检测ATV对HeLa细胞周期的阻滞作用;RT-qPCR、Western Blotting法检测ATV介导的自噬相关蛋白LC3、Beclin-1等表达水平变化;MDC、IFA检测ATV诱导HeLa细胞自噬的能力;通过RNAi敲低LC3及Beclin-1,检测ATV感染参与调控HeLa细胞自噬的相关分子。结果:携带Apoptin基因的ATV通过经典的线粒体凋亡途径,抑制HeLa细胞增殖,其作用具有时间与剂效关系;PI/RNase检测细胞周期实验表明,ATV具有阻滞HeLa细胞周期的作用,从而抑制HeLa细胞增殖;Western Blotting和qPCR实验表明,ATV可诱导HeLa细胞发生自噬;MDC染色、IFA实验表明,ATV诱导HeLa细胞自噬的水平,强于Ad-MOCK;ATV感染HeLa细胞24 h后,自噬受到抑制,而凋亡作用显著增强,怀疑ATV抑制HeLa细胞的方式由自噬转为凋亡;敲低Beclin-1和LC3后,自噬作用减弱,自噬小体减少;ATV感染敲低Beclin-1、LC3的HeLa细胞6 h后,ATG5、ATG12和ULK1等自噬相关分子水平均有所增强,表明ATV介导的HeLa细胞自噬,可能不完全依赖LC3、Beclin-1途径。结论:携带Apoptin的溶瘤腺病毒ATV可通过诱导人宫颈癌HeLa细胞发生凋亡和自噬,进而特异性杀伤肿瘤细胞。
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33

【参考文献】

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本文编号：2716332