STEAP1对子宫内膜癌侵袭转移影响的研究

发布时间：2020-06-18 18:05

【摘要】：研究背景2008年至今的调查研究显示,子宫内膜癌每年的新发病例数占所有女性生殖系统恶性肿瘤患者的第一位,并且己经远远超过了宫颈癌的发病率。而在美国以及欧洲的一些国家,子宫内膜癌己成为女性群体发病频率最高的生殖系统好发的恶性肿瘤,四分之三以上的患者集中在绝经期妇女,属于女性的三大生殖系统癌症之一。根据美国的癌症协会2018年的调查数据显示,子宫内膜癌的新发病患者大约在63230人,而其中的11350名妇女将因该病死亡。近年来,随着子宫内膜癌新发病例数的迅速增加,针对子宫内膜癌的筛查、诊断标准以及外科治疗手段已得到广泛应用。但至今仍没有精准的途径对子宫内膜癌进行预后评估,因此,迫切需要找到一种可评估子宫内膜癌预后的生物标志物,开展靶向治疗。STEAP1是STEAP蛋白家族的重要成员之一,主要定位在质膜上,一般存在与细胞和细胞相互连接的地方。STEAP1参与细胞间通讯,且具有金属还原酶活性,可能与分泌和内吞作用的膜转运功能、细胞凋亡和存活有关。STEAP蛋白家族已被证明在前列腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均存在表达。STEAP1被认为是重要的诊断指标和有效治疗靶点,所以,STEAP1在子宫内膜癌的发病以及转归中具体的作用机制值得深入研究。研究目的1.验证STEAP1在正常子宫内膜以及癌组织、细胞中的表达及其临床意义;2.证经慢病毒调控STEAP1的表达后,子宫内膜癌侵袭性和转移强度发生的改变;3.探索子宫内膜癌的EMT进展中STEAP1的潜在影响机制。研究方法1.利用免疫组织化学实验(IHC)比较STEAPI在正常子宫内膜以及癌组织内的表达差异;2.利用实时逆转录-聚合链反应实验(RT-qPCR)和免疫印迹实验(Western blotting)从mRNA和蛋白水平检测STEAP1在正常子宫内膜细胞以及癌细胞系中的表达差异;3.慢病毒介导的外源性强制增强或抑制子宫内膜癌细胞KLE和Ishikawa中STEAP1的表达,并用RT-qPCR和Western blotting从mRNA和蛋白质水平验证转染效率,检测调控前后STEAP1的表达差异;4.免疫细胞化学法(ICC,细胞爬片实验)检测STEAP1在外源性强制增强和抑制表达的不同侵袭能力的子宫内膜癌细胞系中的表达;5.以Boyden小室为依托,进行Transwell侵袭和转移实验,检测子宫内膜癌细胞系侵袭和迁移能力因慢病毒调控STEAP1的表达而呈现的差异,明确STEAP1在子宫内膜癌细胞侵袭迁徙中的作用机制;6.流式细胞术检测细胞周期以及进行细胞平板克隆实验,检测转染前后的子宫内膜癌细胞的生长和增殖能力,明确STEAP1在其中发挥的作用;7.建立裸鼠体内移植瘤模型,制备外源性强制高表达的STEAP1和沉默STEAP1的细胞悬液,于裸鼠颈背松软的皮肤下分别接种转染成功的细胞,定期观察肿瘤生长速度和体积大小,并记录,自接种日起喂养56天后脱臼处死,并将肿瘤完好的于本体剥离;8.利用RT-qPCR和Western blotting检测调控STEAP1后,细胞和动物体内移植瘤EMT特征标志物基因的表达;9.明胶酶谱实验检测转染前后基质蛋白金属酶MMP2和MMP9的表达情况。研究结果1.子宫内膜癌组织的STEAP1着色强度相对比正常组织明显偏低,STEAP1着色强度与癌组织的分化、浸润深度、淋巴转移和不良预后的发生有显著的相关性联系(P0.05);2.子宫内膜癌细胞的STEAP1表达程度比正常细胞内STEAP1明显偏低(P0.05),且随子宫内膜癌细胞的分化和运动能力增强而减弱,提示STEAP1参与调控子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭;3.在共聚焦高内涵显微镜下观察慢病毒转染的细胞荧光数大于85%,RT-qPCR和Western blotting实验结果支持镜下的结果;4.免疫细胞化学检测结果证实,沉默STEAP1后,癌细胞Ishikawa-shRNA中STEAP1表达降低,过表达STEAP1建立后,癌细胞KLE-exSTEAPl中STEAP1的表达增强;5.子宫内膜癌细胞的侵袭移动过程以及增殖和克隆形成能力受到慢病毒调控STEAP1表达降低得以促进,相反的,因慢病毒调控STEAP1过表达受到明显抑制;6.体内实验表示,接种STEAP1降表达高侵袭转移性细胞组,肿瘤体积较大,结节较多；接种STEAP1过表达低侵袭转移性细胞组,动物形成的移植瘤体积较小、表面光滑,生长速度明显比降表达组慢;7.RT-qPCR、Western blotting和明胶酶谱实验显示,shRNA干扰STEAP1降表达后,子宫内膜癌细胞Ishikawa-shRNA中E-cadherin表达减弱,而Ishikawa-shRNA中的N-cadherin、Vimentin和 Snail、Slug表达强度上升,而且 Ishikawa-shRNA中的Twist、MMP2和MMP9也呈现表达升高的趋势,促进了 EMT进程;相反的,在过表达STEAP1后,子宫内膜癌细胞KLE-exSTEAP1的E-cadherin呈现升高表达,而 KLE-exSTEAPl 中的 Snail、Slug和N-cadherin、Vimentin均呈现出低表达趋势,而且KLE-exSTEAP1中的Twist、MMP2和MMP9也呈现表达减弱的趋势,阻碍了 EMT历程。研究结论1.STEAP1在子宫内膜癌中低表达并且与恶性临床表型、不良预后有关;2.STEAP1可以作为治疗靶点抑制子宫内膜癌的增殖、侵袭性和转移能力;3.STEAP1表达上调可抑制子宫内膜癌中EMT进程。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

癌组织,高分化,低分化

图１邋ＳＴＥＡＰ１在子宫内膜组织内的表达逡逑注．？邋ａ，ｂ分别是正常子宫内膜处于增值和分泌期；ｃ是高分化的Ｉ期癌组织；ｄ逡逑是高分化的ＩＩ期癌组织；ｅ是低分化的ＩＩＩ期癌组织；ｆ是低分化的ＩＶ期癌组织。逡逑＞＜２００。逡逑２４逡逑

患者,子宫内膜癌,生存分析,宫内膜癌

本次分析共包括２４８例子宫内膜癌患者，ＳＴＥＡＰ１低表达患者包括２１１逡逑例，ＳＴＥＡＰ１高表达患者３７例，结果显示，ＳＴＥＡＰ１高表达组患者的生存时间逡逑比ＳＴＥＡＰ１低表达组的患者更长，且更能够获得良好预后，见图２邋（Ｐ＜０．０５）。逡逑２５逡逑

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