YKL-40基因在子宫内膜癌血管形成和抗凋亡机制中的研究

发布时间：2020-06-18 19:35

【摘要】：子宫内膜癌(Endometrial cancer,EC)是女性生殖道三大恶性肿瘤之一,是发达国家最常见的妇科恶性肿瘤,也是发展中国家第二常见的妇科恶性肿瘤。在美国,每年有超过6万个新诊断病例和1万多个死亡病例。子宫内膜癌的发病率有增无减,且趋于年轻化,严重威胁女性的生活质量和生命。虽然子宫内膜癌在早期阶段可通过手术使患者的生存率有所提高,然而,对于转移或复发的患者而言,手术、化疗和放疗均难以达到满意的治疗效果。因此,寻找有效的治疗靶点对子宫内膜癌的临床治疗具有重要意义。大量研究证实,甲壳质酶蛋白40(Chitinase-3-like Protein 1,YKL-40)在多种恶性肿瘤组织和血清中高表达,且与患者短生存期和不良预后密切相关,在肿瘤的早期诊断、治疗和判断预后中具有潜在价值。为探究子宫内膜癌的关键靶点,本课题组前期研究发现,YKL-40在子宫内膜癌患者组织和血清中均呈高表达,且血清YKL-40具有监测病情和判断预后的价值。YKL-40在子宫内膜癌多种细胞株(HEC-1A、HEC-1B、ishikawa、RL-952)中高表达,其中,YKL-40在HEC-1A细胞株中的相对表达量最高,因此选择HEC-1A细胞株作为我们后续研究的细胞模型。采用siRNA技术沉默YKL-40基因能够抑制HEC-1A细胞增殖、迁移、侵袭及抗凋亡能力。本研究是在前期研究的基础上,通过体内外实验初步探讨siRNA沉默YKL-40基因对HEC-1A细胞血管形成和凋亡信号通路关键蛋白的影响,旨在为子宫内膜癌的临床治疗和靶向药物研究提供前期理论基础。第一章YKL-40基因沉默对人子宫内膜癌细胞中VEGF/VEGFR-2/ERK1/2、PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响目的在本课题组前期研究的基础上建立稳定沉默YKL-40基因的人子宫内膜癌HEC-1A细胞系,探讨siRNA沉默YKL-40基因对HEC-1A细胞中VEGF/VEGFR-2/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。方法1、将本课题组前期构建的针对YKL-40基因的慢病毒载体siRNAYKL-40及阴性对照空载体siRNA-NC分别转染至HEC-1A细胞。2、实验分组:以稳定转染siRNA-YKL-40的HEC-1A细胞作为siRNA实验组(si YKL-40);以转染siRNA-NC的HEC-1A细胞作为空载体组(si NC);以未转染的HEC-1A细胞作为空白对照组(Ctrl)。3、用实时荧光定量PCR(q PCR)和蛋白印迹法(western blotting)联合检测HEC-1A细胞沉默YKL-40基因后的沉默效果。4、用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔形成实验检测YKL-40表达沉默对血管形成能力的影响。5、Western blotting检测各组细胞中VEGF、VEGFR-2、p VEGFR-2(Tyr1175)、ERK1/2、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白的表达水平。6、使用不同浓度顺铂(cisplatin,DDP)(0,3.125,6.25,12.5,25,50和100mmol/L)处理HEC-1A细胞48h,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测DDP对HEC-1A细胞生长活性的影响,并计算DDP对各组细胞的半数抑制浓度(IC50)。用DDP的IC50处理上述三组细胞,分4组:空白对照组(Ctrl);DDP+空白对照组(DDP+Ctrl);DDP+空载体组(DDP+si NC);DDP+siRNA实验组(DDP+si YKL-40)。Western Blotting检测以上4组细胞PI3K、p PI3K(Tyr458)、AKT、p AKT(Ser473)蛋白的表达水平。结果1、转染96小时后,转染成功的HEC-1A细胞表达绿色荧光蛋白(GFP),转染效率超过85%,经嘌呤霉素筛选后,GFP稳定表达,且传代培养后转染效率无明显变化。2、检测转染后YKL-40基因的沉默效果:q PCR结果显示,与空载体组(1.01±0.20)和空白对照组(1.12±0.44)相比,siRNA实验组YKL-40m RNA的表达量(0.26±0.06)明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。Western Blotting结果显示,siRNA实验组中的YKL-40蛋白相对表达水平为1.52±0.16,明显低于空载体组(6.21±0.10)和空白对照组(5.65±0.19),差异有统计学意义(P0.05)。3、siRNA实验组的成管数目为6.67±3.51个,明显少于空白对照组和空载体组的成管数目(分别为33.67±10.96个、33±4个),差异有统计学意义(F=14.96,P=0.005)。4、与空载体组及空白对照组相比,siRNA实验组的VEGF、p VEGFR-2(Tyr1175)、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)的相对表达量下降(P0.05),差异有统计学意义。5、MTT结果显示,经DDP处理后,各组细胞的生长活性均随DDP浓度的增加而下降,而siRNA实验组细胞的活性下降更为明显,差异有统计学意义(P0.05)。经计算,DDP的IC50为30mmol/L。Western Blotting结果显示,DDP+si YKL-40组的总AKT、p AKT(Ser473)和p PI3K(Tyr458)的表达水平均低于Ctrl、DDP+Ctrl及DDP+si NC组(P0.05),差异有统计学意义。结论1、成功建立稳定沉默YKL-40基因的HEC-1A细胞系。2、siRNA沉默YKL-40基因后能够显著抑制体外血管形成能力。3、siRNA沉默YKL-40基因能够下调HEC-1A细胞中VEGF、p VEGFR-2(Tyr1175)、p ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白的表达。4、siRNA沉默YKL-40基因可能通过下调p PI3K(Tyr458)、AKT和p AKT(Ser473)蛋白的表达来增强HEC-1A细胞对DDP诱导细胞凋亡的敏感性。目的探讨siRNA沉默YKL-40基因对HEC-1A细胞裸鼠移植瘤模型肿瘤的影响及其机制。方法1、将21只SPF级雌性BALB/c裸鼠随机分为siRNA实验组、空白对照组和空载体组,每组7只。将以上3组细胞(1×107/0.2ml/只)分别接种至裸鼠皮下。成瘤后,每隔3天测量裸鼠皮下肿瘤的长径和短径,并绘制肿瘤生长曲线。第5周以颈椎脱臼法处死各组裸鼠,测量离体肿瘤组织的大小、重量。2、用苏木素-伊红染色(HE染色)观察3组裸鼠肿瘤组织病理形态学特征。3、免疫组化法和western blotting检测移植瘤组织中YKL-40的表达。4、免疫组化法和western blotting检测移植瘤组织中VEGF、EGFR的表达。结果1、siRNA实验组成瘤时间为(9.29±1.50)天,明显长于空白对照组和空载体组[分别为[(4.29±0.76)和(4.14±0.90)天]。siRNA实验组移植瘤组织体积及重量均明显小于空白对照组和空载体组,差异有统计学意义(P0.01);而空白对照组与空载体组比较,差异无统计学意义(P0.05)。与空白对照组和空载体组相比,siRNA实验组抑瘤率分别为78.67%、79.87%。2、HE染色显微镜下观察发现,siRNA实验组肿瘤细胞出现大片坏死,多见核固缩。而空载体组和空白对照组肿瘤细胞核大深染,可见核仁及核分裂,核固缩、坏死区域少。3、采用Image Pro Plus6.0软件(IPP)分析免疫组化图片,siRNA实验组YKL-40蛋白的表达量明显低于空白对照组和空载体组(P0.01),差异有统计学意义。Western Blotting结果显示,与空白对照组、空载体组相比,siRNA实验组YKL-40的表达量明显降低(P0.01),差异有统计学意义。4、采用IPP分析免疫组化图片,与空白对照组、空载体组相比,siRNA实验组裸鼠肿瘤组织中的VEGF、EGFR的表达水平明显下降(P0.01)。Western blotting结果显示,与空白对照组、空载体组相比,siRNA实验组裸鼠肿瘤组织中的VEGF、EGFR的表达水平均明显下降(P0.01)。结论1、siRNA沉默YKL-40基因能够抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长。2、siRNA沉默YKL-40基因可能通过下调VEGF和EGFR蛋白的表达来抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

荧光显微镜,胞转,视野,荧光

见图 1-2。图 1-1 倒置荧光显微镜下细胞转染效率（20 ）A：明视野；B：荧光视野Fig 1-1 Transfection efficiency of HEC-1A cells under fluorescence microscope (20 )A: Bright field; B: Dark field

胞转,荧光显微镜,效率,转染

届硕士学位论文 YKL-40 基因在子宫内膜癌血管形成和抗凋亡机制中果慢病毒载体 siRNA-YKL-40 转染情况转染 96 h 后，在倒置荧光显微镜下可观察到转染成功的 HEC-1A绿色荧光蛋白（GFP）。与明视野相比，荧光视野可见大量细胞表达效率超过 85%，且传代培养后细胞状态良好，转染效率无明显改 1-1。用 1 μg/mL 浓度的嘌呤霉素进行筛选，2 周后在倒置显微镜定转染 siRNA-YKL-40 的 HEC-1A 细胞株，可见 GFP 稳定表达-1A 细胞。见图 1-2。

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