雌激素调控输卵管上皮胃饥饿素基因表达信号通路研究

发布时间：2020-07-04 06:25

【摘要】：目的:雌激素作为一种重要的甾体类激素,广泛参与机体细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程。有研究表明,血液雌激素变化与雌性动物细胞内胃饥饿素(GHRL)基因表达呈正相关,说明雌激素可能参与GHRL基因表达的调控。多囊卵巢综合征(PCOS)是人类妇科常见病,病症之一是血液中雄激素水平高,而雌激素水平低。认为PCOS与血液胃饥饿素(GHRL)有关。本研究分为两部分。第一部分运用Meta统计分析方法,分析人外周血胃饥饿素水平与PCOS关系研究。第二部分研究以绵羊输卵管上皮细胞为材料,研究雌激素调控输卵管上皮胃饥饿素基因表达信号通路,为研究雌激素、胃饥饿素、多囊卵巢综合征关系奠定基础。本文首先检索PubMed和Web of Science数据库2015年2月之前的相关文献,搜索关键词为Ghrelin(GHRL)和PCOS,按照Meta分析方法要求进行搜索,共获得符合条件的20篇研究文献。采用Meta分析法,分析了与这些文献对应的20项研究内容,这些研究涉及894例多囊卵巢综合征(PCOS)患者和574例正常女性。分析显示,PCOS患者的血液胃饥饿素(GHRL)水平显著低于正常女性对照组,标准差(SMD)为-0.71(95%CI:-1.20,-0.23)。其次,通过分子生物学及细胞生物学手段,研究雌激素诱导绵羊输卵管上皮细胞GHRL表达过程中的GPER/MAPK/ERK1/2信号通路。具体如下:建立绵羊输卵管上皮细胞培养体系。采用胰酶消化法获得绵羊输卵管上皮细胞,进行原代培养,通过改善细胞培养环境增加绵羊输卵管上皮细胞的纯度。通过形态学、免疫荧光及western blot方法鉴定培养的细胞为上皮细胞。同时,分别在基因水平和蛋白水平检测绵羊输卵管上皮细胞中GPER、ERα、ERβ的表达情况。免疫荧光和Western blot检测传代细胞上皮标志CK18和E-cadherin,确定所培养的细胞为上皮细胞。免疫组化结果显示绵羊输卵管组织中GPER为细胞膜及细胞质着色,ERα及ERβ分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核,且ERβ呈弱表达。用传代绵羊输卵管上皮细胞作为实验材料,分别在基因水平和蛋白水平观察GHRL在绵羊输卵管上皮细胞中的表达情况。结果表明绵羊输卵管上皮细胞中有GHRL基因表达,免疫组化结果显示GHRL蛋白主要表达在黏膜层的上皮细胞内。分别用不同浓度的GPER受体激动剂G-1和雌激素处理细胞,并在不同时间点收样,用实时荧光定量PCR检测GHRL基因的表达水平,结果显示G-1和E_2均能显著上调GHRL的表达水平,1×10~(-8)mol/L E_2诱导组和1×10~(-7)mol/L G-1诱导组GHRL相对表达量达到最高。最佳诱导剂量的E_2和G-1分别处理细胞6h和3h后,GHRL相对表达量达到最高。为了验证E_2和G-1与输卵管上皮细胞增殖的调控关系,分别使用E_2和G-1处理细胞后,分别检测输卵管上皮细胞增殖相关基因PCNA mRNA表达量变化。结果表明,最适剂量的E_2和G-1处理细胞后PCNA表达水平随时间增加而升高,呈现明显的时间依赖性。取同批次绵羊输卵管上皮细胞,使用最佳浓度17-β雌二醇处理细胞,然后利用western blot方法在不同时间点检测MAPK/ERK通路中蛋白组分表达量的变化。结果显示,其磷酸化水平p-ERK蛋白表达量从5 min开始逐渐升高,持续升高至30 min时,达到峰值。取同批次绵羊输卵管上皮细胞,分别加入最适剂量E_2和GPER激动剂G-1,在30 min时提取细胞总蛋白,检测MAPK/ERK通路中蛋白组分表达量的变化。结果显示,G-1处理组和E_2处理组ERK总蛋白表达量无明显变化,G-1处理组和E_2处理组磷酸化水平p-ERK蛋白表达量均升高,且明显高于对照组。免疫组化结果显示,绵羊输卵管黏膜层上皮细胞和固有层细胞均有ERK1/2蛋白表达,主要着色蛋白位于胞质,少数胞核也有阳性表达。分别加入GPER的激动剂G-1、GPER激动剂G-1+MAPK/ERK抑制剂U0126(30μM)及E_2+MAPK/ERK抑制剂U0126(30μM)处理细胞6h后,提取细胞总RNA,利用RT-qPCR方法检测各组GHRL基因表达量的变化情况。结果显示,E_2处理组与G-1处理组均显示出明显的促进GHRL表达的效应(P0.01),G-1的促进表达能力高于E_2(P0.05)。17-β雌二醇和G-1的促进表达效应均能够被U0126阻断(P0.05)。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R711.75
【图文】：

序列,外显子,基因,内含子

图 1 GHRL 发现过程[5]Fig 1. The GHRL discovery processGHRL 基因及蛋白乳动物中，GHRL是一种促进食欲，并协调能量和生殖活动平衡的胃肠布在胃组织中。具有活性的GHRL要经历从GHRL基因到GHRL蛋白的修饰和进化过程。 GHRL 基因结构及多态性的 GHRL 基因位于染色体 3p25-26，包括 4 个内含子和 5 个外显子，in 基因也由 5 个外显子组成[6,7]。鸡的 GHRL 基因 DNA 序列全长 27064 个内含子连接 5 个外显子组成。人的 GHRL 第一个外显子不编码蛋白显子只有 20bp，编码非翻译区的一部分。HRL 核心启动子长约 200bp，上游具有一个长约 5000bp 的调控序列基因表达。

辛酰基,氨基酸组成,前体,识别部位

图 2 人和鼠的 GHRL 结构[5]Fig. 2 The GHRL structure of human and mouse化 GHRL 的过程中，根据第三位丝氨酸是否酰辛酰化的 GHRL（C8:0）、脱酰化的 GHRL（C10:1）。这些 GHRL 由 27 或 28 个氨基酸组氨基酸组成的 GHRL 多羧基端（COOH-）的。GHRL 主要有两种分子存在形式，即第 3辛酰基化，N 端辛酰基化对生物活性具有重程中，先产生由 117 个氨基酸组成的前体，然的活性 GHRL。GHRL 前体 N 端的前 23 个氨 24-51（24-50）位的 28（或 27）个氨基酸为端 P-R，即脯氨酸-精氨酸结构为其识别部位化的 GHRL 一般不具备生物活性[5]。

【参考文献】