Let-7b在胚胎停育发生中的作用及分子机制的研究

发布时间：2020-07-15 08:47

【摘要】：胚胎停育,亦称为稽留流产(Missed abortion;MA),在我国的发病率正逐年提升,严重危害了患者的身心健康,而遗传因素是目前国内外学者所公认的导致胚胎停育发生的主要诱因,但其分子机制尚不明确。microRNA作为一种非编码RNA广泛的参与了细胞的增殖、凋亡等胚胎发育的多种生物学过程。为了研究miRNAs与MA发病的相关性,我们利用候选基因法在胚胎停育的胎盘组织中筛选了差异表达的miRNAs,同时配合原位杂交以及real-time PCR两种方法来对筛选出的miRNAs进行验证,结果显示let-7b,miR-21,miR-125b和miR-483在MA患者和孕早期正常绒毛组织中均有广泛的表达,主要分布在滋养层细胞以及间质细胞中。与对照组相比let-7b、miR-125b的表达量显著上调,miR-483的表达量显著下降(p0.05)。为了进一步探究胚胎停育发生的分子机制,我们利用米非司酮对孕鼠的腹腔进行单次注射来构建胎停动物模型,结果显示当药物浓度达到4mg/kg时,孕鼠胚胎表现为稳定的吸收。与对照组相比,let-7b的表达量上调(p0.05),这与其在人胎盘组织中的表达趋势一致。我们课题组前期的研究显示let-7b在大鼠胚胎植入后表达显著下调,那么,我们考虑let-7b在胚胎停育组织中表达量上调也可能是引起胚胎停育的原因之一。为此,本研究选择let-7b来深入探讨miRNA参与调控胚胎停育的分子机制。首先,我们分析了 let-7b在不同细胞系中的表达量,为进行细胞功能实验选择细胞系提供参考;然后,利用EdU,MTT,Transwell小室以及流式细胞分析术来研究let-7b的表达量差异对细胞的生物学功能的影响;接着利用生物信息学网站来分析预测let-7b的靶基因。随后利用双荧光素酶报告系统在对靶基因进行验证,最后利用Real-time PCR、Western Blot对靶基因的表达水平进行了探究。研究结果显示,在不同细胞系中let-7b的表达量存在着显著性差异,在滋养层细胞HTR8中let-7b的表达量相对较低,而在人子宫内膜腺癌细胞HEC-1B中表达量有着显著的提高(P0.01)。利用不同浓度米非司酮处理细胞造成损伤后,发现let-7b的表达量有着显著的上调趋势(P0.01)。当过表达let-7b时,细胞的增殖能力得到了抑制,而凋亡、迁移及浸润能力得到增强(P0.05),当敲低let-7b的表达时出现了相反的趋势。双荧光素酶报告系统验证了 MAPK6为let-7b的靶基因,real-time PCR、western blot对MAPK6表达水平进行分析后发现其表达模式与let-7b的相反,提示let-7b可能通过影响了 MAPK6的表达,从而参与调控了胚胎停育的发生过程。结论:Let-7b在胚胎停育患者和米非司酮诱导的胚胎停育模型胎盘组织中均表达显著上调,其可通过靶向调节MAPK6的表达抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡、迁移与浸润过程,进而参与了胚胎停育的发生。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.21
【图文】：

排布,方式,统计学意义,年龄

国医学科学院北京协和医学院逦硕士研究生学位检验的方法进行比较，以＊邋ＰＣ０．０５代表该差异具有统计学意义；多组间ＮＯＶＡ分析，同样以＊邋Ｐ＜０．０５表示该差异具有统计学意义。逡逑实验结果逡逑排布信息逡逑龄与妊娠期疾病的发生密切相关，因而在本研究中，依据孕妇妊娠时标本其分为四个组别，依次为：年龄小于等于２５周岁组（ＹＳ２５）、２６－：邋２６－３０）组、３１－３５岁组（Ｙ：邋３１－３５）、以及年龄大于等于３６周岁组（Ｙ＞收集到的组织按照年龄组配对分类，排列设计成组织芯片如图１所示，号为胎停绒毛组织，偶数编号为对照组，具体信息详见表２：逡逑４－Ｊ

视野,原位杂交,胎盘绒毛,绒毛组织

２．１．１原位杂交逡逑以锁核酸标记的探针检测ｍｉＲ－２１在正常及早期胎停组织中绒毛的表达定位如逡逑图２．１所示：ｍｉＲ－２１表达定位结果显示其阳性信号主要定位于胎盘绒毛合体滋养层逡逑和间质细胞中。ｍｉＲ－２１的整体表达水平较高，与对照组比较，随机选取五个视野的逡逑灰度值分析结果提示ｍｉＲ－２１在四个组别之用的阳性位点着色强度并未统计出显著逡逑性的差异，总体分析时发现病例组中出现下调的趋势，但是没有差异，这提示在胚逡逑胎停育这一病理过程中，ｍｉＲ－２１并未出现在胎盘绒毛组织中的差异表达，但其是否逡逑确定为参与调控这一生物学过程的发生，仍有待进一步验证。逡逑２０－２５ｙｅａｒｓ邋２６－３０ｙｅａｒｓ邋３１－３５ｙｅａｒｓ邋３６－４０ｙｅａｒｓ逡逑Ｂ逦Ｃ逡逑Ｈ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逦８０＇逡逑ｉｉｉｒ邋＿逡逑ｚ邋ｊ邋ｚ逦ｙ逡逑－ｒ邋ｓ－－逦■￥逦、逡逑图２．１邋ｍｉＲ－２１原位杂交结果图逡逑Ａ：ｍｉＲ－２１在正常胎盘绒毛组织与胎停绒毛组织中的表达（２００ｘ）；邋Ｂ：四个年龄组中，正常逡逑胎盘绒毛组织与胎停绒毛组织原杂结果平均灰度值比较；Ｃ：对照组与病例组ｍｉＲ－２１原杂结逡逑果灰度值的比较。逡逑１４逡逑

绒毛组织,年龄组,患者,显著性差异

硕士研究生学位论文逡逑２．１．２邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ逡逑如图２．２所示，利用ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ的方法检测ｍｉＲ－２１表达量的差异，挑选出逡逑的４０对胎停样本结果显示：与对照组相比，胚胎停育患者中ｍｉＲ－２１的总体表达量逡逑上调，且具有显著性差异（Ｐ＜０．０１），而在四个不同年龄组中，ｍｉＲ－２１的表达量均逡逑有上调的趋势，但未能统计出显著性差异。但这也有可能是个别个体间差异较大，逡逑而未能产生的差异结果。对不同年龄段配对的病例组和对照组进行表达趋势分析逡逑后，发现在２０－２５周岁这里年龄段里，ｍｉＲ－２１上调的百分比最高为５０％，且个别胎逡逑停样本组织内ｍｉＲ－２１的表达量显著上调（尸＜０．００１），这提示ｍｉＲ－２１可能与胚胎逡逑停育相关，但其可能参与的调控其发生的具体分子机制仍然需要进一步的探究。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｓ邋２５－｜逦＊＊逦＝邋１５－，逦—逡逑｜逦２逦■邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｔ邋２０－逦—■￣逦Ｈ逦ｔ逦ｔ邋■邋ｃａｓｅ逡逑ｆｉｓ．逦｜＇°逦１逡逑Ｃ邋１５0ｌ逦Ｉ１０＇逦Ｉ邋５－逡逑Ｖ邋５＇逦＾逡逑｜逦１邋ｐｉ邋Ｉ邋逦

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