间充质干细胞联合PGS支架移植对宫腔粘连性子宫内膜损伤的修复作用及机制研究

发布时间：2020-07-15 12:03

【摘要】：宫腔粘连(IUA)是一种常见的获得性子宫内膜疾病,其主要继发于子宫内膜损伤(包括创伤、刮宫、感染、子宫先天性异常等)。近年来,随着宫腔操作增多继而加重的子宫内膜损伤使得IUA的发病率呈快速增长的态势,其已成为导致育龄期女性不育的最重要的原因之一。当前,针对IUA的治疗措施主要为宫腔镜下分离粘连(transcervical resection of adhesion,TCRA),然后术后应用雌激素、宫内放置节育器防止粘连的再形成。然儿,对于重度IUA患者,TCRA后其子宫内膜发生再粘连的概率仍然高达20%~62.5%,其妊娠成功率仅为22.5%~33.3%。因此,我们迫切需要开发治疗IUA的替代方法。干细胞治疗对于损伤疾病或病症是一种有前景的方法。直至目前,科学家已经在临床前动物模型和临床研究中探索了不同来源的干细胞治疗子宫内膜损伤的效果。然而,前期的研究中,移植干细胞的方式为子宫局部原位注射或者螺旋动脉推注。干细胞经子宫局部原位注射后在内膜损伤部位存活数量少,而经螺旋动脉推注移植后募集效率低,使得治疗后成功受孕率不理想。研究者采用不同的方法来克服移植干细胞存活率低的问题。他们发现,一些生物材料(如聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架、水凝胶和纳米结构脂质载体)可以提高干细胞的存活率,从而改善干细胞治疗的效果。有研究报道,胶原支架搭载骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可以促进子宫内膜细胞和肌细胞的增殖,恢复子宫内膜支持胚胎定植和成熟的能力。然而,经上述方法移植后的干细胞存活率仍然有限。此外,胶原蛋白作为一种生物源性生物材料,其可重复性较差,存在引起超敏反应、传播疾病和免疫原性反应的潜在风险。聚癸二酸甘油(PGS)是一种广泛应用于生物医学领域(尤其是软组织再生领域)合成生物弹性体。其具有良好的弹性,使其在动态机械环境下能够很好地维持和恢复软组织的各种变形,而不会对周围组织产生机械性刺激。同时,干细胞在子宫内膜损伤中的修复作用和其治疗机制仍不清楚。本课题中,我们比较了PGS支架、PLGA支架、胶原支架搭载BMSCs和局部原位注射移植治疗大鼠子宫内膜损伤的效果。我们的研究结果表明,PGS支架提供的3D结构有利于大鼠BMSCs的附着和生长。小动物活体成像结果显示,与局部原位注射BMSCs和PLGA支架、胶原支架搭载移植相比,PGS支架搭载移植明显延长了大鼠子宫内膜损伤模型中BMSCs的滞留时间。我们还发现,PGS支架搭载移植组的子宫内膜组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达水平显著高于局部原位注射移植组和PLGA支架、胶原支架搭载移植组。此外,PGS支架搭载BMSCs移植较局部原位注射和PLGA支架、胶原支架搭载移植更能促进损伤子宫内膜的形态恢复。妊娠功能测试结果显示,PGS支架搭载BMSCs移植组的子宫受孕率(73.6±1.1%)显著地高于胶原支架搭载移植组(54.7±1.6%)和PLGA支架搭载移植组的受孕率(42.3±1.4%)。综上,PGS支架搭载BMSCs移植可能是预防IUA的一种有前景方法。目前认为,干细胞修复子宫内膜损伤的可能机制包括:(1)通过产生抗炎性细胞因子和生长因子抑制局部炎症损害;(2)通过自分泌和旁分泌产生细胞因子诱导子宫内膜损伤部位血管生成。然而,我们对于非编码基因在干细胞促进子宫内膜损伤修复的机制还不了解。外泌体(exosome)是一种具有脂质双层膜结构,含有细胞特异性蛋白、脂质和核酸,介导细胞间信号分子传递从而影响细胞功能的一种小囊泡,其在很多病理、生理过程中(如免疫抗原呈递、肿瘤生长与迁移、组织损伤修复等)起着极其重要的作用。在本论文研究中,我们发现,BMSCs治疗后,大鼠机械性损伤子宫内膜中microRNA 340(miR-340)水平显著升高。然后,我们应用过表达或敲减的方法上调或下调BMSCs细胞及其相应外泌体中miR-340的表达来检测外泌体是否介导了BMSCs与子宫内膜实质细胞之间的miR-340传递。我们发现,与对照组相比,来源于过表达miR-340 BMSCs(miR-340~+BMSCs)或正常BMSCs的外泌体处理可以显著地上调子宫内膜间质细胞(ESCs)中miR-340的表达水平,而来源于敲减miR-340 BMSCs(miR-340~-BMSCs)的外泌体无此效应。接着,我们进一步使用外泌体抑制剂GW4869验证了外泌体介导了BMSCs与ESCs间miR-340的传递过程。在体内,我们采用红色荧光标记外泌体的方法证明,来源于BMSCs的外泌体可以转移到邻近的ESCs中。与对照组相比,BMSCs治疗可以显著地促进损伤子宫内膜的功能恢复和抑制其胶原蛋白1α1(Collagen1α1)、α-SMA和转化生长因子(TGF)-β1的表达。miR-340~+BMSCs治疗可以显著地增强BMSCs治疗的效果,而miR-340~-BMSCs显著地减弱了BMSCs的治疗效果。体外实验结果表明,来源于BMSCs外泌体的miR-340可以抑制ESCs中TGF-β1诱导的纤维化相关基因的表达。这些数据表明,骨髓间充质干细胞能够通过外泌体将miR-340传递给ESCs来发挥其的抗纤维化作用。因此,增强骨髓间充质干细胞来源的外泌体相关的miR-340传递可能是预防子宫内膜粘连的一种有前景的方法。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.74
【图文】：

我们根据之前文献所述的癸二酸和甘油的酯化反应合成PGS[33]，其平均分子量为 24.3 kDa，多分散性指数为 1.30。然后，通过盐浸出方法合成 PGS 多孔支架，其孔隙度为 90.6±0.7%。扫描电镜（SEM）结果显示，整个 PGS 多孔支架内分布着大量互联的孔隙，孔径大小为（75 - 150μm）（图1-1A，B）。此外，在大孔壁上还出现了一些微孔（几微米）。这种分层多孔结构使有效的质量交换和细胞通信成为可能。差示扫描量热法（DSC）结果表明，PGS 支架的 Tg 为 33.1℃以及其两个熔点为 9.7℃和 24.8℃（图 1-1 B），这表明化学交联的 PGS 支架是无定型的，在体温下可能具有弹性。我们采用压缩试验研究了 PGS 支架、PLGA 支架、胶原支架、子宫组织的力学性能。实验结果显示，PGS 多孔支架的模量（2.61±0.07 kPa）与大鼠子宫组织（2.71±0.17 kPa）相近，而 PLGA 支架的模量（21.53±2.30 kPa）和胶原支架的模量（63.91±5.94kPa）显著大于大鼠子宫组织的模量（图 1-1C）。循环压缩试验表明，与 PLGA和胶原支架相比，PGS 支架在动态变形下具有更好的弹性和疲劳耐久性，且有一定的滞后效应（图 1-1 D-F）。

间充质干细胞,神经元特异性烯醇化酶,软骨细胞,神经元

大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定Figure1-2.BMSCsidentification(A)ThemorphologicalcharacteristicsoftheBMSCsatthethirddayundertheopticalmicroscope.(B I)DetectingthesurfacemarkersinratBMSCsbyflowcytometry.

支架,原位,子宫,保留时间

海军军医大学博士学位论文表明，PGS支架搭载BMSCs移植组的BMSCs保留量高于局部原位注射组、PLGA支架搭载 BMSCs 组和胶原支架搭载 BMSCs 组（图 1-3 L-O）。这表明，PGS 支架搭载 BMSCs 移植比 BMSCs 局部原位注射、PLGA 支架搭载 BMSCs 和胶原支架搭载 BMSCs 具有更强的延长 BMSCs 滞留子宫腔内时间的能力。移植后，骨髓间充质干细胞的长时间存留有利于受损子宫内膜的修复。

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