子宫内膜干细胞对小鼠薄型子宫内膜修复作用的研究

发布时间：2020-07-22 05:02

【摘要】：目的:1.探讨一种简捷、易行且高效的体外分离、培养及鉴定子宫内膜干细胞的方法,并对子宫内膜干细胞进行细胞形态学检测以及表面标志物鉴定。2.通过苏木素-伊红染色、免疫组织化学检测及生育力评估等手段研究宫腔原位注射95%乙醇建立薄型子宫内膜小鼠模型的可行性,为薄型子宫内膜的相关研究提供理想的动物模型。3.通过苏木素-伊红染色、免疫组织化学检测及生育力评估等手段探讨子宫内膜干细胞宫腔原位移植对小鼠薄型子宫内膜的作用,为薄型子宫内膜的修复研究及临床诊治提供新思路。方法:1.选择产后21d的雌性C57BL/6J小鼠作为提取子宫内膜干细胞的实验动物,通过机械分离与两步酶消法体外分离、培养C57BL/6J小鼠的子宫内膜干细胞。分离、培养子宫内膜干细胞,进行细胞形态学检测,并采用CCK-8法测定细胞增殖曲线。流式细胞仪检测子宫内膜干细胞表面标记物CD29、CD45、CD73、CD105及CD117的表达情况。2.选择6~8周龄SPF级性成熟且未交配C57bl/6J雌性小鼠84只作为实验动物,通过宫腔原位注射95%乙醇损伤子宫内膜建立薄型子宫内膜小鼠模型。将84只实验小鼠随机分为两大组,其中一组小鼠36只。于造模后第三个动情期将实验小鼠颈椎脱臼处死,收集子宫样本,观察子宫形态,进行HE染色、子宫内膜厚度测量等;免疫组织化学检测细胞角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子和雌激素受体α的表达情况。另一组小鼠48只,又随机分为空白组、对照组、单侧损伤组和双侧损伤组,造模后所有存活小鼠于第三个动情期进行合笼交配,分析小鼠生育能力的情况,从功能方面评估薄型子宫内膜小鼠模型是否建立成功。3.选择6~8周龄SPF级性成熟且未交配C57bl/6J雌性小鼠192只作为实验动物。小鼠右侧一侧子宫通过宫腔注入95%乙醇建立单侧薄型子宫内膜小鼠模型,小鼠左侧一侧子宫作为自身正常对照。将模型鼠随机分为磷酸盐缓冲溶液(PhosPhate buffered solution,PBS)注射3d对照组(模型鼠损伤侧子宫给予PBS 0.1 mL,n=24);PBS注射7d组(损伤侧子宫给予PBS 0.1 mL,n=24);PBS注射14d组(损伤侧子宫给予PBS 0.1 mL,n=24);PBS注射30d组(损伤侧子宫给予PBS 0.1 mL,n=24);子宫内膜干细胞移植3d组(造模后,损伤侧子宫立即宫腔原位移植子宫内膜干细胞0.1 mL,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24);子宫内膜干细胞移植7d组(造模后,损伤侧子宫立即宫腔注射子宫内膜干细胞0.1 mL,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24);子宫内膜干细胞移植14d组(造模后,损伤侧子宫立即宫腔注射子宫内膜干细胞0.1 ml,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24);子宫内膜干细胞移植30d组(造模后,损伤侧子宫立即宫腔原位移植子宫内膜干细胞0.1 ml,2×10~8/L~5×10~8/L,n=24。分别于子宫内膜干细胞/PBS移植后的第3、7、14和30天颈椎脱臼处死小鼠,固定子宫组织标本,每组12只。HE染色观察子宫内膜组织状态,测量子宫内膜厚度;免疫组化检测子宫内膜中角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子和雌激素受体α的表达以评估子宫内膜细胞的再生情况;同时,每组其余小鼠于取样的相应时间点进行合笼交配,分析子宫内膜干细胞移植对小鼠生育力的影响,从功能方面评估子宫内膜干细胞对小鼠薄型子宫内膜的作用。结果:1.通过机械分离与两步酶消法获得的子宫内膜干细胞可贴壁生长,以梭形细胞为主,呈漩涡状或辐射式生长。P1,P3子宫内膜干细胞增殖曲线均呈S型,存在一定的滞留期、对数期和平台期;经冻存复苏后的子宫内膜干细胞的生长状态正常;流式细胞仪检测结果显示CD29、CD73和CD105均表达为阳性,CD45,CD117表达为阴性。2.HE染色结果发现,实验组部分小鼠的子宫出现了宫腔堵塞现象,并且实验组小鼠子宫内膜层明显变薄,腺体数量减少,局部血管稀疏。免疫组织化学结果显示,实验组小鼠子宫内膜细胞角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子和雌激素受体α的表达均较空白组与对照组显著降低。生育力评估实验结果显示合笼交配后,空白组和对照组小鼠正常受孕,双侧损伤实验组小鼠未受孕,单侧损伤实验组损伤侧子宫未受孕,未损伤侧子宫正常受孕,且损伤侧子宫的平均怀孕率较未损伤侧显著降低(P0.01),表明宫腔注入95%乙醇能够损伤小鼠子宫内膜,导致生育力降低。3.HE染色结果显示子宫内膜干细胞移植后,子宫内膜干细胞移植组较相应PBS对照组的子宫内膜水肿程度明显减轻,状态较好,宫腔粘连、堵塞情况显著降低,且腺体、血管数量增多;子宫内膜厚度明显增厚,且差异均有统计学意义(P0.05)。免疫组化结果显示,各子宫内膜干细胞移植组细胞角蛋白、波形蛋白、血管内皮生长因子和雌激素受体α的平均光密度值明显高于相应PBS对照组(P0.05),且与其他治疗组相比,子宫内膜干细胞移植30d组各指标的表达量差异具有显著性(P0.01),但仍低于左侧正常子宫对照组(P0.05)。生育力评估实验结果显示合笼交配后,各组左侧正常子宫正常受孕,右侧PBS 3d、7d和14d对照组子宫未受孕,且右侧各子宫内膜干细胞移植组子宫的平均怀孕率明显高于PBS对照组;与子宫内膜干细胞移植3d和7d组相比,干细胞移植14d组右侧子宫的怀孕率差异具有统计学意义(P0.05),而干细胞移植30d组差异具有显著性(P0.01),表明子宫内膜干细胞宫腔原位移植对小鼠薄型子宫内膜有一定的修复作用,并可提高生育力。结论:1.通过机械分离与两步酶消法分离、培养的子宫内膜干细胞体外增殖能力强,纯度高,生长状态佳,是获得子宫内膜干细胞简便、有效的方法,且所获细胞可作为相关研究的种子细胞。2.本研究建立了稳定的薄型子宫内膜小鼠模型,该模型可用于薄型子宫内膜病理机制及修复的相关研究。3.子宫内膜干细胞经宫腔原位移植于薄型子宫内膜小鼠,可不同程度的增加子宫内膜厚度,促进子宫内膜细胞再生,修复子宫内膜受损组织以及提高小鼠生育力,提示子宫内膜干细胞移植对薄型子宫内膜有一定的修复作用。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.74
【图文】：

干细胞,原代培养,贴壁细胞

离心 5min；弃上清，加入 10mLPBS，1500rpm 离心 5min；弃上清液，加入 500μLPBS 重悬细胞，制成 1.0×106/ml 的细胞悬液，平均分成 5 管；每管按说明书分别加入不同量的特定抗体（抗 CD29-APC、抗 CD45、抗 CD73-FITC、抗 CD105-FITC、抗 CD117-FITC），4℃避光孵育 30min 后流式细胞仪检测。2 结果2.1 小鼠子宫内膜干细胞的体外培养与传代接种后于倒置显微镜下观察可见细胞量多，且主要是圆形细胞悬浮于培养液中。约 24h 后即可见少量贴壁细胞，且细胞形态不一；3d 后观察可见贴壁细胞明显增多，多呈梭形；培养 4-5d 后可见贴壁细胞呈漩涡状或辐射式生长；7-10d 后即可见细胞集落融合成片，铺满培养瓶底部（见图 1-1）。

子宫内膜,冷冻复苏,天图,冻存

注：A：P3 子宫内膜干细胞培养第 1 天；B：P3 子宫内膜干细胞培养第 3 天；C：P3 子宫内膜干细胞培养第 5 天图 1-2 传代后小鼠子宫内膜干细胞的培养2.2 小鼠子宫内膜干细胞的冻存和复苏冻存的子宫内膜干细胞复苏后，显微镜下观察可见大量的圆形细胞。接种约 24h可见大部分的细胞已贴壁生长，多呈梭形。经冷冻复苏后的细胞生长较慢，约 12-14d才能长至铺满瓶底，但经传代后的细胞生长速度加快，约 6-7d 即可进行再次传代（见图 1-3）。

干细胞,冻存,子宫内膜,冷冻复苏

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