重度子痫前期患者特异性IPS细胞系的建立及向滋养样细胞分化的初步研究

发布时间：2020-07-23 01:12

【摘要】：第一部分重度子痫前期患者特异性i PS细胞系的建立目的用仙台病毒将重度子痫前期患者脐血CD3+T细胞重编程为iPSC,建立重度PE患者特异性的i PS细胞系。方法利用Ficoll梯度分离法分离重度PE患者的3ml脐血中单个核细胞,待T细胞在CD3和IL-2的激活作用下扩增5-7天后用携带OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC基因的仙台病毒转染。将转染出现的IPSC克隆种植在饲养层MEF培养。对IPSC进行碱性磷酸酶染色,免疫细胞化学检测多潜能分子标志物OCT4,TRA-1-60,NANOG,SOX2,细胞株体外传代及扩增后进行核型分析。结果仙台病毒转染T细胞10-15天出现多个IPSC克隆,转染效率0.02-0.04%。这些IPSC碱性磷酸酶染色阳性,表达多能性标志物,传至40代后核型仍正常。结论重度PE患者少量脐血样本可经仙台病毒高效重编程为IPSC,IPSC具有全能性,扩大了IPSC的来源细胞标本,延伸了IPSC的临床应用,为探索PE为代表的滋养细胞发育异常相关疾病奠定了良好基础。第二部分无饲养层下特异性iPSC定向分化为滋养样细胞目的iPSC转至无饲养层上稳定培养后在小分子(BMP4)的作用下将重度子痫前期患者特异性iPSC定向分化为滋养样细胞。方法选择状态良好的iPSC种植在提前包被Matrigel的六孔板里传代后改用m TeSR1基础培养基培养iPSC,接着利用含10ng/ml人BMP4的无饲养层基础培养基培养5-7天诱导细胞滋养细胞(CTB)分化后继续分化至功能性滋养样细胞。动态观察分化后细胞形态变化,免疫检测滋养细胞标志物顺序表达,检测滋养细胞HCG分泌。结果IPSC在无饲养层条件下多次传代后仍状态良好,分化后的细胞形态为滋养细胞形态,表达CTB标志物CDX2,且第6天时阳性率最高大于80%,继续分化可表达EVT特异性标志物HLA-G、分泌HCG。结论重度子痫前期患者的IPSC可在无饲养层下经BMP4高效分化为CTB,且可继续分化为具有分泌功能的滋养样细胞。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.244
【图文】：

脐血,细胞,细胞悬液

华中科技大学硕士学位论文出冻存管，快速放入 37 度水浴锅中确保在 1min 内解冻细胞悬液。吸出细胞悬液，缓慢滴入已经准备好的离心管中，离心 1000rx5min。③弃上清，加 IPSC 培养液重悬细胞，按照冻存管上标记的密度接种于 MEF 上，放入培养箱中培养。3 实验结果3.1 培养 PBMC。利用 Ficoll 液分离脐血后得到的第二层白膜层即为 T 细胞层，呈“云雾状”，界线肉眼可见（图 1）。初重悬的 T 细胞显微镜下显示圆形、分散、透亮，在 CD3 和 IL-的作用下，T 细胞抱团生长，逐渐增多，5-7 天后，出现较多细胞团，T 细胞呈圆形集簇、色深（图 2），此时的细胞可收集用于转染。

细胞,细胞悬液,集簇,内解

形态图,转染,形态,细胞团

华中科技大学硕士学位论文在 SeV 转染后 10-15 天，六孔板中逐渐出现多个小的细胞团，即为 IPS 细胞团，团内细胞核质比较大，紧致而边界清晰。细胞团出现后再培养 1 周左右，细胞团明显增大，边界仍清晰，呈扁平状，此时可将充分展开的大的细胞团（图 3）挑至新的六孔板中培养。将六孔板置于显微镜下观察，可见 IPSC 呈致密集落样，集落饱满，边缘光滑（图 4）。本研究中，我们每次转染选取 1X105PBMC 转染，获得 20-40 个克隆，转染效率 0.02-0.04%，效率较高。

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