血清外泌体microRNAs在卵巢癌诊断中的应用价值及miR-1246对卵巢癌细胞生物学行为影响的体外研究

发布时间：2020-07-23 04:01

【摘要】：第一部分血清外泌体microRNAs在卵巢癌诊断中的应用价值目的:研究表明,肿瘤细胞来源的外泌体中含有大量的microRNAs,其表达水平与肿瘤的发生发展密切相关,本研究初步探讨血清外泌体中microRNAs在卵巢癌中的应用价值。方法:1.收集外周血标本:卵巢癌40人,良性卵巢肿瘤15人,健康对照30人。2.采用Minute高效外泌体沉淀方法对血清中外泌体进行提取并使用Western blot对外泌体蛋白CD9和CD63的表达进行鉴定,应用miRNA纯化试剂盒提取外泌体中miRNAs。3.应用实时荧光定量PCR法对外泌体中miR-101-3P、miR-320a、miR-3184和miR-1246表达量进行检测,应用SPSS21.0软件进行统计分析。以P0.05为差异具有统计学意义。结果:1.我们通过外泌体沉淀法提取出了血清中的外泌体,Western blot结果显示提取的外泌体高表达CD9和CD63蛋白。2.本次研究初筛入选了4个肿瘤相关microRNAs分别为miR-101-3P、miR-320a、miR-3184和miR-1246。初筛组中我们纳入了15名卵巢癌和15名健康对照,实时定量PCR结果显示,miR-101-3P,miR-320a和miR-1246在卵巢癌组和健康对照组中的稳定表达,miR-101-3P和miR-320a在初筛组的卵巢癌组和健康对照组中的表达没有显著性差异(P0.05),仅miR-1246在初筛组的两组间具有差异性表达(P0.05)。3.验证组中分为25名卵巢癌患者,15名良性卵巢肿瘤以及15名健康对照。实时定量PCR结果表明,miR-1246在卵巢癌组中表达明显高于良性卵巢肿瘤组和健康对照组,差异具有显著性(P0.05)。良性卵巢肿瘤中miR-1246的表达高于健康对照组,但是差异并不显著(P0.05)。4.对25例卵巢癌患者进行ROC曲线分析。结果显示,miR-1246、CA125以及二者联合检测的ROC曲线下面积分别为0.819、0.898和0.909。通过ROC曲线求得miR-1246的cutoff值为9.947,血清外泌体中miR-1246以及CA125的灵敏度为0.680和0.800,特异度分别为0.897和0.735.联合诊断可以提高miR-1246的灵敏度和诊断效能。5.通过双变量相关性分析血清外泌体中miR-1246表达量与血清CA125和HE4水平,结果表明miR-1246与CA125和HE4均呈显著正相关(CA125,r=0.644,P=0.001;HE4,r=0.581,P=0.002)。6.双变量相关性分析结果显示,miR-1246的相对表达水平与年龄(r=-0.291,P=0.703)和卵巢癌的组织学类型无关(r=0.111,P=0.597)。miR-1246与疾病分期(r=0.607,P=0.005),腹盆腔及远处转移相关(r=0.485,P=0.014),CA125阳性表达水平(r=0.430,P=0.032)等相关。结论:本研究发现卵巢癌患者血清外泌体miR-1246表达具有显著性差异,有潜力作为新一代卵巢癌诊断的生物学标志物。第二部分mi R-1246对卵巢癌细胞株生物学行为影响的体外研究目的:第一部分结果显示,mi R-1246在卵巢癌患者血清外泌体表达具有显著性差异,本部分研究mi R-1246分子对卵巢癌细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡的影响方法:1.实验分为两组,分别为mi R-1246低表达组包括mi R-1246 inhibitor组和mi R-1246 inhibitor NC组以及mi R-1246高表达组包括mi R-1246mimic组和mi R-1246 mimic NC组。分别用mi R-1246 inhibitor、mi R-1246inhibitor NC、mi R-1246 mimic以及mi R-1246 mimic NC转染SKOV3细胞。2.应用实时定量PCR法检测转染后SKOV3细胞中mi R-1246的表达情况。3.采用细胞划痕实验观察转染后细胞横向迁移能力的改变,采用Transwell小室技术来检测卵巢癌细胞的纵向迁移和侵袭能力。4.使用CCK-8法测定评估细胞增殖率。使用流式细胞术检测转染后细胞的凋亡率。结果:1.实时荧光定量PCR结果显示mi R-1246 mimic组的SKOV3细胞中mi R-1246表达水平量明显高于mi R-1246 mimic NC组(P0.05),mi R-1246inhibitor组中mi R-1246表达水平量明显低于mi R-1246 inhibitor NC组(P0.05)。2.细胞划痕实验检测卵巢癌细胞横向迁移率,结果表明mi R-1246mimic组的细胞迁移率明显高于mi R-1246 mimic NC组(P0.05),mi R-1246 inhibitor组的细胞迁移率明显低于mi R-1246 inhibitor NC组(P0.05)。3.Transwell实验结果显示,与mi R-1246 mimic NC组相比,mi R-1246mimic组的细胞迁移和侵袭到下室的细胞数明显增多(P0.05)。mi R-1246inhibitor组的迁移和侵袭到下室的细胞数明显少于mi R-1246 inhibitor NC组(P0.05),说明mi R-1246抑制剂明显抑制了细胞的迁移和侵袭能力(P0.05)以及mi R-1246具有促进SKOV3卵巢癌细胞迁移和侵袭的能力。4.CCK-8细胞增殖能力检测结果发现,相比较于mi R-1246 mimic NC组,mi R-1246 mimic组的细胞增殖能力显著提高(P0.05);mi R-1246inhibitor组的细胞增殖能力与mi R-1246 inhibitor组相比显著下降(P0.05)。实验说明mi R-1246可促进SKOV3卵巢癌细胞的增殖。5.细胞凋亡实验结果表明mi R-1246 inhibitor组的细胞凋亡率相较于mi R-1246 inhibitor NC组显著升高(P0.05);mi R-1246 mimic组的细胞凋亡率相较于mi R-1246 mimic NC组显著下降(P0.05),这说明mi R-1246可抑制SKOV3卵巢癌细胞的凋亡。结论:通过卵巢癌细胞体外实验可知,mi R-1246在卵巢癌的发生发展中发挥着促癌基因的作用,可以提高卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭,促进卵巢癌SKOV3细胞的增殖并抑制其凋亡。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31
【图文】：

Westenblot检测外泌体表面标志分子Fig.1Westernblotanalysisofexosomesurfacemarkermolecules

初筛组中候选microRNA的PCR扩增曲线图

初筛组中候选miRNAs的熔解曲线

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 陈燕;林莺莺;郑瑜宏;胡敏华;陈岩松;;血清HE4、CA125和ROMA指数评估卵巢癌风险性的初步评价[J];中国免疫学杂志;2013年02期

本文编号：2766818