汉族人精子线粒体CO1基因变异与精液质量及体外完全受精失败的相关性研究

发布时间：2020-07-25 14:34

【摘要】：背景与目的近年来,随着生活节奏加快、工作压力增加、环境污染恶化、饮食结构改变等,不孕症已成为全球性的公共健康问题。除女性排卵障碍及输卵管功能障碍两大不孕因素外,男性因素导致不育也越来越常见,并且许多研究表明男性精子数量和生育能力在不断的下降。引起精子质量下降的因素很多,其中包括有毒环境的暴露、精索静脉曲张、物理及精神因素。随着分子生物学及基因研究的不断深入,一些学者进一步将目光投向了精子线粒体,有国外学者发现线粒体基因片段缺失与男性不育之间有着密切的关系。我们前期探讨了精子线粒体基因MT-ATP6、MT-ND3、MT-ND6及MT-ND2等基因变异与体外完全受精失败的相关性,但MT-CO1基因的变异情况我们尚不了解。在本研究中,我们发现近5年人精子线粒体CO1基因发生了较为明显的变异,而且基因变异具有一定的规律性。因此,我们尝试探讨汉族人精子线粒体CO1基因变异是否影响男性精子质量及与完全体外受精失败的相关性。研究方法1样本的收集1.1:收集2010-2018年就诊于郑州大学第二附属医院生殖中心的343例IVF周期男性患者的精液进行回顾性分析。1.2:收集2018年9月-11月就诊于郑州大学第二附属医院门诊的19位产褥期女性志愿者,各取2ml外周静脉血,门诊收集8名两周岁之内的婴幼儿外周静脉血各1ml。1.3:征集6名男性志愿者取其精液、外周静脉血及其亲生母亲外周静脉血。1.4:收集5位男性不同年份(2012年及2018年)的精子进行研究对象的自身前后对照研究。1.5:于2018年9-11月在我生殖中心收集40余枚卵胞浆单精子注射过程中废弃的未成熟卵子。2实验方法2.1通过巢式PCR和DNA测序分析线粒体CO1基因的变异情况,检测结果经mitomap数据库(www.mitomap.org)中记录的人类剑桥序列(rCRS)进行比对,并记录变异位点。2.2应用Uniport datebase和Polyphen-2软件对变异位点进行蛋白质功能预测;swiss-model软件同源建模预测蛋白质三级结构并通过TM-Align软件计算野生型蛋白及突变型蛋白与数据库中蛋白高级结构之间的RMSD差值,评估SNP对蛋白空间结构稳定性的影响。2.3将343例精子样本根据年份分组,观察其线粒体CO1基因变异情况;评价人精子线粒体CO1基因变异是否影响男性精子质量及与完全体外受精失败的相关性。统计学方法计量资料应用平均数±标准差表示,分类计数资料应用数和百分比表示。计量资料用独立样本t检验分析,计数资料用卡方检验或Fisher精确检验分析。所有分析均采用双侧检验,P0.05为差异具有统计学意义。所有样本数据经SPSS21.0统计学软件进行计算。结果1.汉族精子线粒体测序共发现75个纯合变异,66个杂合变异,其中新发现纯合位点1个,新发现杂合位点11个。2.观察精子线粒体CO1基因所有变异位点,我们发现自2014年起,精子线粒体CO1基因除了散在位点的变异以外,开始出现一组由G6023A、T6221C、C6242T、A6266C、A6299G、G6366A、G6383A、C6410T、C6452T、C6483T、T6512C、C6542T、C6569A、T6641C、C6935T、C6938T、A7146G、C7232T、C7256T和G7316A这20个固定位点组成的特异性的基因变异及C7028T位点的回复变异。我们在本文中将包含所有20个固定变异位点的线粒体CO1基因定义为变异型基因,20个位点均未发生变异的线粒体CO1基因定义为野生型基因。线粒体CO1变异型基因在血液样本中均未检测到。3.精子线粒体CO1变异型基因中G6366A和A7146G两个位点变异为错义变异,经蛋白功能预测提示这两处错义变异对蛋白质功能影响并不明显。经swiss-model软件同源建模预测的蛋白质三级结构,结果发现野生型蛋白RMSD=0.1;变异型蛋白RMSD=1.24,提示变异型蛋白高级结构比野生型蛋白高级结构稳定有所下降。4.精子密度在野生型基因组及变异型基因组之间无明显差异,P0.05;精子活力(a+b级)在两组间有差异,野生型基因组精子平均活力明显高于变异型基因组,P0.05。5.精子线粒体CO1变异型基因与体外完全受精失败无明显相关性,P0.05。6.分析每一个精子线粒体CO1基因的每一个变异位点,我们发现2010至2013年,纯合变异位点T5999C(0%vs 5.26%)、G6179A(0%vs 5.26%)、C7028T(87.64%vs 71.05%)和杂合变异位点A7241G(0%vs 5.26%)在正常受精组与完全受精失败组之间有差异,P0.05;2014至2018年,纯合变异位点G6383A(59.34%vs 38.89%)、C7028T(17.58%vs 47.22%)、C7232T(53.85%vs 33.33%)和杂合变异位点G6023A(38.46%vs 11.11%)、T6221C(38.46%vs 13.89)、C6242T(39.56%vs 13.89%)、A6299G(46.15%vs 13.89%)、G6366A(50.55%vs16.67%)、C6410T(39.56%vs 13.89%)、C6452T(37.36%vs 13.89%)、C6483T(38.46%vs 13.89%)、T6512C(54.95%vs 16.67%)、C6542T(45.05%vs 13.89%)、C6569A(40.66%vs 13.89%)、T6641C(31.87%vs 13.89%)、C6935T(43.96%vs16.67%)、C6938T(42.86%vs 13.89%)、C7028T(52.75%vs22.22%)、A7146G(34.07%vs13.89%)、C7232T(31.87%vs13.89%)、C7256T(58.24%vs16.67%)、G7316A(48.35%vs25%)在正常受精组与完全受精失败组之间有差异,P0.05。结论近8年汉族人精子线粒体CO1基因出现了一组以G6023A等20个位点基因变异及C7028T位点的回复变异为特征的变异,我们将G6023A等20个位点同时发生变异的线粒体CO1基因定义为变异型基因,变异型基因编码蛋白质仍具有一定的生物学功能,但其空间结构的稳定性有所降低。精子线粒体CO1基因变异对精子密度无明显影响,但可能是引起精子活力下降的原因之一。汉族人精子线粒体CO1基因变异对体外受精失败的影响不是一成不变的,而是处于一个动态变化的过程中。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.8
【图文】：

分子结构图,位点,野生型,静脉血

型（b）CO1 基因编码蛋白模拟三维结构图；野）、野生型位点 7146A（e）、变异位点 7146G（男性精子、静脉血和其母亲静脉血的 M男性中有 5 例精子线粒体基因 6023 位点发位点均为 G。检测结果见表 3、波形图见子精子、静脉血和其母亲静脉血 MT-CO1 基因

波形图,静脉血,精子,母亲

10图 2：男子精子、静脉血及其母亲静脉血 6023 位点对比波形图 2. 3 组样本男方精子、静脉血及其母亲静脉血的 6023 位点波形图。1 号男性精子、静及其母亲静脉血中 6023 位点均为野生型 G；2 号及 5 号男子精子线粒体 6023 位点均发 G/A 的杂合变异，静脉血中均为野生型。1.4 经过对 5 组男性不同时期（2012 年及 2018 年）的精子的 MT-CO1 基023 位点的检测自身比对显示：5 名男性 2012 年精子线粒体 6023 基因位点

波形图,波形图,基因,野生型

11图 3：自身对比基因波形图野生型，A 为变异型。NO.1-2012 为 1 号志愿者 20野生型 G，NO.1-2018 为 1 号志愿者 2018 再次取精后O.3-2012 为 3 号志愿者 2012 年精子样本 6023 位点检志愿者 2018 年再次取精对 6023 位点的检测结果改：19 位产褥期女性静脉血、8 名两周岁之内的

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