ARRDC3与子痫前期相关性的研究

发布时间：2020-07-31 13:09

【摘要】：第一部分ARRDC3与子痫前期相关性的研究目的1.研究子痫前期胎盘组织中ARRDC3表达情况及缺氧对滋养细胞ARRDC3表达的影响。2.研究缺氧条件下ARRDC3表达对滋养细胞侵袭及血管形成的影响。方法1.利用生物信息学方法分析四组子痫前期表达谱基因芯片中的差异表达基因,从差异表达基因中挑选出与缺氧代谢、细胞侵袭及血管形成相关的基因——ARRDC3。2.免疫组化检测10例子痫前期胎盘组织样本和10例正常胎盘组织样本中ARRDC3表达分布,Western Blot检测10例子痫前期胎盘组织样本和10例正常胎盘组织样本中ARRDC3蛋白的表达。3.建立绒毛外滋养细胞系HTR8/SVneo细胞体外缺氧模型,Western Blot检测缺氧对HTR8/SVneo细胞ARRDC3蛋白的表达的影响、EDU增殖实验检测缺氧对HTR8/SVneo细胞增殖的影响、Transwell小室法检测缺氧对HTR8/SVneo细胞侵袭能力的影响、Tube formation法检测缺氧对HTR8/SVneo细胞血管形成能力的影响、流式细胞凋亡实验检测法检测缺氧对HTR8/SVneo细胞凋亡的影响。4.构建ARRDC3重组质粒,用lipo2000转染HTR8/SVneo细胞,Western Blot检测ARRDC3过表达效率,EDU增殖实验检测ARRDC3过表达对HTR8/SVneo细胞增殖的影响、Transwell小室法检测ARRDC3过表达对HTR8/SVneo细胞侵袭能力的影响、Tube formation法检测ARRDC3过表达对HTR8/SVneo细胞血管形成能力的影响、流式细胞凋亡实验检测法检测ARRDC3过表达对HTR8/SVneo细胞凋亡的影响。5.构建 ARRDC3 特异性 siRNA,用 lipo2000 转染 HTR8/SVneo 细胞,Western Blot检测ARRDC3沉默效率,Transwell小室法检测ARRDC3沉默对HTR8/SVneo细胞侵袭能力的影响、Tube formation法检测ARRDC3沉默对HTR8/SVneo细胞血管形成能力的影响、流式细胞凋亡实验检测法检测ARRDC3沉默对HTR8/SVneo细胞凋亡的影响。6.应用HIF-2 α抑制剂处理HTR8/SVneo细胞,Western Blot检测缺氧条件下HIF-2 α 及 ARRDC3 表达。结果1.利用生物信息学分析方法总共鉴定出277个共同的差异表达基因,其中ARRDC3与缺氧代谢、细胞侵袭及血管形成有关。免疫组化检测显示ARRDC3在胎盘组织滋养细胞及血管内皮细胞表达丰富,主要分布于细胞膜。Westren Blot检测显示子痫前期胎盘组织中ARRDC3表达显著高于正常胎盘组织。2.体外绒毛外滋养细胞系HTR8/SVneo细胞缺氧模型中,Westren Blot检测显示缺氧诱导HTR8/SVneo细胞ARRDC3表达,EDU增殖实验检测显示缺氧对HTR8/S Vneo细胞增殖无显著影响、Transwell小室法检测显示缺氧抑制HTR8/SVneo细胞侵袭、Tube formation法检测显示缺氧抑制HTR8/SVneo细胞血管形成、流式细胞凋亡实验检测法检测显示缺氧促进HTR8/SVneo细胞凋亡。3.构建的HTR8/SVneo细胞ARRDC3过表达模型中,Westren Blot检测显示转染ARRDC3过表达质粒HTR8/SVneo细胞中ARRDC3表达相对于对照组提高了(80.08±7.32)%,EDU增殖实验检测显示ARRDC3过表达对HTR8/SVneo细胞增殖无影响、Transwell小室法检测显示ARRDC3过表达抑制HTR8/SVneo细胞侵袭、Tube formation法检测显示ARRDC3过表达抑制HTR8/SVneo细胞血管形成、流式细胞凋亡实验检测法检测显示ARRDC3过表达对HTR8/SVneo细胞凋亡无显著影响。4.构建的HTR8/SVneo细胞ARRDC3沉默模型中,Westren Blot检测显示转染ARRDC3特异性siRNA的HTR8/SVneo细胞中ARRDC3表达相对于对照组下降了(75.12 ± 5.30)%,Transwell小室法检测显示ARRDC3沉默促进HTR8/SVneo细胞侵袭、Tube formation法检测显示ARRDC3沉默促进HTR8/SVneo细胞血管形成。5.用HIF-2 α抑制剂处理HTR8/SVneo细胞后,Westren Blot检测显示缺氧条件下HIF-2 α抑制剂抑制不仅抑制HIF-2 α蛋白表达而且抑制ARRDC3蛋白表达。结论子痫前期胎盘组织中ARRDC3表达显著高于正常胎盘组织。缺氧诱导HTR8/SVneo细胞ARRDC3表达,抑制HTR8/SVneo细胞增殖、侵袭,促进HTR8/SVneo细胞凋亡。ARRDC3的过表达抑制HTR8/SVneo细胞侵袭及血管形成,ARRDC3的沉默促进HTR8/SVneo细胞侵袭及血管形成。缺氧条件下HIF-2 α诱导ARRDC3表达。研究结果揭示了 ARRDC3与子痫前期发病的相关性。第二部分子痫前期与胎盘血管重铸障碍及母体血管因子紊乱的研究进展(综述)子痫前期是一种妊娠相关的特殊疾病,是围产期孕妇及胎儿致病和死亡的主要原因。子痫前期发病机制不明,但胎盘螺旋动脉重铸障碍和血管生成因子及抗血管生成因子的失衡在子痫前期发生发展中起重要作用。母体外周循环血液中血管生成因子及抗血管生成因子可以用于子痫前期发病的预测及子痫前期新疗法的开发。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.244
【图文】：

图２．子痫前期与正常妊娠胎盘血管重铸的比较ｔｊｋ意图（引自Ｐｅｒｅ－Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ逡逑Ａｌ，ｅｔ邋ａｌ．邋Ｒｅｐｏｒｔ邋Ｓｃｉ．２０１３，２０（９）：邋１０２０－９．）逡逑为了探索缺氧条件下参与子痫前期发生发展的相关基因，我们从ＧＥＯ数据逡逑库下载了与子痫前期相关的四个基因芯片，利用生物信息学分析筛选出了目标逡逑基因一含有抑制蛋白结构域蛋白３（Ａｒｒｅｓｔｉｎ邋Ｄｏｍａｉｎ邋Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋３，ＡＲＲＤＣ３）。逡逑ＡＲＲＤＣ３是ａ邋－抑制蛋白家族成员，它与哺乳动物ｐ邋—抑制蛋白具有相似的结构逡逑域［１２］，邋ＡＲＲＤＣ３含有两个Ｃ末端ＰＰＸＹ基序，它们可以结合含ＷＷ结构域的逡逑蛋白质，包括含ＨＥＣＴ结构域的Ｎｃｄｄ４样Ｅ３泛素连接酶［１２］。先前的研究表明逡逑ａ邋－抑制蛋白家族成员充当衔接子／支架将Ｎｃｄｄ４样Ｅ３泛素连接酶募集至其底物逡逑以降解［１３］。最近研究发现，ＡＲＲＤＣ３与癌症有着密切关联，ＡＲＲＤＣ３已成为逡逑调节多种细胞功能的肿瘤抑制因子［１４－１６］。过去几十年的研究表明，滋养细胞逡逑和癌细胞在增殖、迁移和侵袭等细胞行为学功能上具有极其相似的特征［１７］，逡逑

出了７８７３，邋３８１４，邋１１９７９邋和邋１３２８邋个差异表达基因（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ，逡逑ＤＥＧｓ），对四个基因表达谱分析数据的差异表达基因取交集，得到２７７个共同逡逑表达的差异表达基因（图１Ａ）。本研究主要聚焦缺氧条件下滋养细胞行为学的逡逑变化研宄，尤其是侵袭和血管形成功能，通过生物信息学分析和文献检索发现逡逑在２７７个基因中ＡＲＲＤＣ３涉及到细胞的侵袭、血管形成及缺氧相关代谢。为了验逡逑证ＡＲＲＤＣ３在子痫前期发生发展中的潜在作用，利用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ分逡逑别从转录水平和翻译水平检测ＡＲＲＤＣ３在子痫前期胎盘组织和正常胎盘组织中逡逑表达差异，结果显示ＡＲＲＤＣ３的ｍＲＮＡ及ＡＲＲＤＣ３蛋白表达水平在子痫前期胎逡逑盘组织中均明显高于正常胎盘组织（图１Ｂ＆Ｃ＆Ｄ）。利用免疫组化检测逡逑ＡＲＲＤＣ３在胎盘组织中的定位及表达，结果显示ＡＲＲＤＣ３在胎盘各层中都有表逡逑达，主要在滋养细胞和血管内皮细胞的胞膜及胞质表达，且子痫前期胎盘组织逡逑中阳性染色强度明显大于正常胎盘组织（图１Ｅ）。逡逑２２逡逑

图２缺氧缺氧诱导滋养细胞ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ中ＡＲＲＤＣ３的表达图逡逑Ａ－Ｂ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测显示缺氧增加滋养细胞ＡＲＲＤＣ的蛋白水平表达。Ｃ：细胞逡逑免疫荧光显示缺氧和常氧条件下滋养细胞ＡＲＲＤＣ３的表达水平；逡逑＊＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０１．逡逑２．３缺氧调节滋养细胞行为学功能逡逑在人绒膜外滋养细胞系ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ构建滋养细胞缺氧模型中，ＥＤＵ增逡逑殖检测实验检测缺氧２４小时对ＴＲ８／ＳＶｎｅｏ细胞增殖的影响，如图３Ａ、３Ｂ所示逡逑１°／０0２缺氧２４小时ＴＲ８／ＳＶｎｅｏ细胞增殖率与常氧组没有显著差异（Ｐ＞０．０５）。逡逑Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室法检测１％０２缺氧２４小时对ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ细胞侵袭能力的影响，逡逑如图３Ｃ、３Ｄ所示缺氧组侵袭到Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室下表面的细胞数与常氧组相比明逡逑显减少（Ｐ＜0．0５），分别为（４５．３８±４．２７）、（８０．５６±５．６７）。小管形成法检测１％０２缺逡逑氧２４小时对ＨＴＲ８／ＳＶｎｅｏ细胞血管形成能力的影响。如图３Ｅ、３Ｆ所示，缺氧逡逑Ｐ＜．，．．、逡逑

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