滋养细胞PPARγ经外泌体介导调控的胎儿脂肪生成机制研究

发布时间：2020-07-31 19:25

【摘要】：研究背景及目的:胎儿生长受限(FGR)在我国的发生率为8.77%,是围生儿死亡的第二大原因。有研究表明脂肪生成障碍是生长受限胎儿与正常胎儿的主要区别之一,而过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是调节脂糖代谢,促进脂肪分化成熟最重要的因子。本项目拟应用分子生物学、细胞生物学、药理学等方法从组织、细胞、个体三个层次阐明滋养细胞PPARγ经外泌体介导的母胎界面的对话机制,探讨以滋养细胞PPARγ为靶点调控胎儿脂肪生成的可行性,为FGR防治提供新的思路和证据。方法:(1)收集正常妊娠及FGR妊娠胎盘组织,利用RT-qPCR、western blotting、免疫荧光及免疫组化等方法检测胎盘组织中PPARγ及其磷酸化水平、脂代谢相关因子SREBP1、C/EBPα、SIRT1、PGC-1α及ACC的表达水平及其活性形式;油红O染色检测胎盘组织中脂肪形成状况以确定FGR胎盘与正常胎盘是否存在PPARγ表达及活性变化、脂质代谢紊乱及两者间的联系。(2)构建由Tet-on系统介导的条件性PPARγ敲降慢病毒(Tet PPARγ-knockdown)并转染HTR8/SVneo滋养细胞株及3T3-L1前脂肪细胞株,随后用HTR8/SVneo、Tet PPARγ-KD HTR8/SVneo及Tet NC HTR8/SVneo细胞或其上清液中的外泌体分别与3T3-L1、Tet PPARγ-KD 3T3-L1及Tet NC 3T3-L1进行共培养并诱导分化,利用油红O染色、RT-qPCR等方法检测前脂肪细胞的分化成熟状况及脂质代谢相关因子的表达情况;(3)利用RUPP手术构建FGR动物模型,于孕13.5天开始每天通过尾静脉注射胎盘靶向纳米颗粒包裹的PPARγ激动剂罗格列酮,于孕18.5天处死孕鼠,用物理学方法对胎鼠进行形态学测量;用DXA对胎鼠进行体成分分析;用western blotting、RT-qPCR、油红O染色等方法检测孕鼠胎盘组织PPARγ活性变化、胎鼠脂肪组织生成状况及其脂肪代谢相关因子的表达情况;(4)标记老鼠胎盘来源的外泌体并通过尾静脉注射入孕鼠体内,随后利用双光子显微镜、小鼠活体成像及共聚焦显微镜检测标记的外泌体以探索外泌体在母胎对话间的作用;(5)收集不同孕周老鼠的胎盘组织、胎鼠及不同的胎鼠器官,利用共聚焦显微镜、western blotting等方法检测PPARγ在胎盘、胎鼠及不同胎鼠器官中的表达以明确孕期胎盘滋养细胞PPARγ对胎鼠生长发育尤其是脂肪生成的必要性。结果:(1)正常及FGR妊娠的胎盘组织实验显示,PPARγ在FGR胎盘组织中的表达水平及活性均明显降低,脂肪酸代谢通路中的各种因子如ACC及PGC-1α的活性在FGR胎盘组织中均有不同程度下降,而各孕周胎盘组织油红O染色并未发现胎盘组织本身存在脂肪生成差异。(2)HTR8/SVneo细胞与3T3-L1细胞共培养可明显促进3T3-L1及Tet PPARγ-KD 3T3-L1前脂肪细胞的分化成熟,而PPARγ敲降后的HTR8/SVneo细胞对3T3-L1细胞的分化成熟不再具有促进作用,与HTR8/SVneo-3T3-L1细胞共培养相比,HTR8/SVneo细胞上清液外泌体与3T3-L1细胞共培养具有同样的促前脂肪细胞分化作用,而去外泌体的HTR8/SVneo上清液及PPARγ敲降后的HTR8/SVneo外泌体对3T3-L1的分化成熟不再具有促进作用。(3)动物实验表明,RUPP手术可导致明显的胎鼠生长发育迟缓、胎鼠脂肪组织百分比下降,而从孕中期开始使用PPARγ激动剂罗格列酮之后,胎鼠的生长发育及胎鼠脂肪组织百分比均显著改善,且胎鼠脂肪组织中的脂肪代谢相关调控分子的表达均有不同程度的变化。(4)小鼠活体成像、双光子显微镜及共聚焦显微镜结果均显示,孕鼠胎盘组织分泌的外泌体可通过脐带转运至胎鼠体内。(5)各孕周孕鼠胎盘、胎鼠及不同胎鼠器官PPARγ表达检测显示,PPARγ在整个孕期的胎盘组织中均处于高表达状态,其表达量远远高于胎鼠的不同器官组织。结论:(1)FGR胎盘组织中存在PPARγ表达及活性下降以及脂质代谢紊乱;(2)滋养细胞PPARγ可经外泌体介导进入前脂肪细胞并显著改善其分化成熟;(3)孕期胎鼠所需的PPARγ依赖于胎盘组织通过胎盘分泌外泌体提供,在孕期上调胎盘PPARγ活性可显著改善胎鼠生长发育及脂肪生成。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.5
【图文】：

而增强细胞间信息传递、易化细胞间对话[24,25]。研究表明[26,27]：早在妊娠第 6 周，即可在母血中检测到胎盘滋养细胞来源的外泌体，且随着妊娠的进展，母体血浆中胎盘滋养细胞来源的外泌体会不断增加，至孕晚期，母体血浆中胎盘滋养细胞来源的外泌体将比孕早期高约 10 倍。妊娠期糖尿病（GDM）早、中、晚孕期母体血浆中胎盘来源的外泌体均明显高于同孕龄正常孕妇，且从 GDM 孕妇血浆中提取的外泌体可有效刺激内皮细胞释放炎症因子[26]。分别从早、中、晚孕期孕妇血浆中提取的外泌体均可明显促进血管形成及内皮细胞增殖、迁移[26,27]。由此可见，妊娠期胎盘来源的外泌体对胎盘形成及发育、母胎对话具有重要作用。综上所述，我们推测胎盘滋养细胞 PPARγ与/或其下游效应分子，经外泌体运输，实现与胎儿前脂肪细胞的对话并调控其向成熟脂肪细胞分化，促进胎儿脂肪生成（图 1 研究假说示意图）。因此，妊娠胎盘滋养细胞 PPARγ活性异常，可能引起胎盘脂质代谢紊乱、能量代谢失衡及胎儿脂肪生成障碍，并最终导致 FGR 发生。

人正常及FGR妊娠胎盘组织PPARγ表达及活性检测Figure1.1PPARγexpressionandactivationdetectioninhumannormalandFGRplacentatissuesA:ConfocalimagesofPPARγimmuofluorescentstaininginhumannormalandFGRtermplacentatissues.B:RT-qPCRshowingrelativePPARγmRNAexpressioninhumannormalandFGR

.2 正常及 FGR 胎盘组织脂肪代谢相关指标bolism related factors detection in human notissueshowing relative C/EBPα、SREBP1 precursorplacenta tissues, n=7 in each group. B: Weste (t-ACC) expression in human normal and Flotting showing relative SIRT1 and PGC-1α e, n=7 in each group. Data were presented as ing normal group.及胎儿皮下脂肪 PPARγ表达及脂果显示：在妊娠 14 周、17 周、21 周-PPARγSer273及 PPARγ的总蛋白表达量不同孕周胎盘组织免疫组化检测同样发

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本文编号：2776902