血浆游离DNA在上皮性卵巢癌中的临床应用研究

发布时间：2020-08-02 20:23

【摘要】：背景:血浆游离DNA(circulating cell free DNA,ccfDNA)是细胞外游离存在于血液中的短片段DNA,主要来源于凋亡或坏死的细胞。健康人ccfDNA的含量较低,肿瘤患者体内由肿瘤细胞释放游离DNA可直接反映患者的分子信息,并使体内ccfDNA含量相应增加,对肿瘤的诊断具有重要意义。目的:探索血浆游离DNA含量及甲基化在上皮性卵巢癌诊断中的应用价值。方法:收集2016年4月至2017年1月上海交通大学附属仁济医院收治的上皮性卵巢癌患者术前外周血和健康女性外周血。使用Qiagen QIAamp循环游离DNA试剂盒提取入组人群的血浆游离DNA,采用Qubit 3.0荧光计定量血浆游离DNA浓度,完成ccfDNA提取。随后对样本进行重亚硫酸盐处理、文库构建、目标区域富集、上机测序。t检验评估ccfDNA浓度在EOC患者和健康人中的差异,Pearson检验、Spearman检验进行ccfDNA与临床特征相关性分析。Wilcoxon Rank Sum检验筛选EOC患者与对照组ctDNA差异甲基化位点,构建差异甲基化位点的联合诊断模型。Wilcoxon Rank Sum检验筛选早期和晚期、淋巴结转移与无转移EOC患者ctDNA差异的甲基化位点。结果:(1)上皮性卵巢癌患者ccfDNA浓度显著高于健康女性(P0.001),ROC曲线下面积为0.755(P0.001)。(2)上皮性卵巢癌患者ccfDNA浓度与肿瘤体积的对数呈正相关(r=0.78,P0.001),但与患者年龄、病理类型、FIGO分期、淋巴结转移情况、单双侧、CA125水平及Ki67表达量无显著相关性(P0.05)。(3)上皮性卵巢癌患者ccfDNA存在128个差异甲基化位点(P0.05);128个差异甲基化位点的联合诊断模型曲线下面积平均为91.7%;模型稳健性分析曲线下面积平均为98%(P0.05)。(4)早期EOC患者与晚期EOC患者ccfDNA存在7个差异甲基化位点;淋巴结转移与无转移EOC患者ccfDNA存在21个差异甲基化位点(P0.05)。结论:血浆游离DNA浓度有助于上皮性卵巢癌的诊断,并可间接反映卵巢癌患者体内的肿瘤负荷;上皮性卵巢癌患者ctDNA差异甲基化位点有助于EOC的诊断,并对其分期、肿瘤转移等临床状态的评估具有一定的参考价值。提示ccfDNA有望成为上皮性卵巢癌诊断及临床监测的新方法。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

②无恶性疾病；③签署知情同意书，同意使用其样本及临床资料。（4）对照组排除标准：①孕妇；②有感染、免疫性疾病、手术等严重的内外科疾病；③恶性病家族史。（5）本研究退出标准：①入组后发现患者不符合纳入标准的病例，或符合排除标准的病例；②受试者撤回知情同意书，要求退出。根据知情同意书的规定，受试者有权中途退出试验，或受试者虽未明确退出试验，但不再接定期随访而失访（也属于退出，或称脱落）。应尽可能了解退出的原因，并加以记录。入组流程见图 1。

上海交通大学医学院 2015 级硕士研究生毕业论文1.2 实验流程的建立本研究在获取患者知情同意后，抽取病例组术前肘静脉血 10ml，健康成年外周肘静脉血 10ml。采用差速离心法分离血浆和血细胞；分离提取血浆游NA，测其浓度，拟采用重亚硫酸盐测序方法，捕获 DNA 片段进行注释和甲基测，送广州市基准医疗有限公司临床医学实验室测序，测序完毕后所有生物与测序数据返还仁济医院妇产科，随后对测序结果进一步分析和解读，实验图见图 2。

图 3.Anchor IRISTM构建技术路线图Fig 3. Flow chat of Anchor IRISTMLibrary construction.标区域富集与上机测序区域富集及上机测序是通过定制目标基因组区域的探针，与基因组，将目标区域 DNA 富集后进行高通量测序，本研究目标区域富集及州市基准医疗有限责任公司完成。我们定制了一个包含 9390 个肿瘤位点的测序 panel，测序深度为 10000X。原位杂交：使用 AnchorDxEpiVisioTMTarget Enrichment Kit，由于涉心技术，仅提供大致操作流程：NA 文库与 HE、HBA 和 HBB 封闭液混合。用热处理的真空系统进行干燥。

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