体外受精出生小鼠心肌组织肾素-血管紧张素系统表达变化及机制研究

发布时间：2020-08-02 21:21

【摘要】：第一部分体外受精出生小鼠心肌组织肾素-血管紧张素系统表达的变化目的:评估体外受精(IVF)出生小鼠从幼年到老年的心肌组织肾素-血管紧张素系统(RAS)各基因及其心血管效应基因表达变化。材料及方法:1.利用C57BL/6J小鼠建立IVF及体内受精小鼠(in vivo)模型。出生小鼠饲养至3周,10周及1.5年时,分别给予安乐死获取两组小鼠的心脏组织。2.TRIZOL法抽提小鼠心肌组织中的总RNA,逆转录成cDNA后,通过荧光定量PCR技术,测定两组中RAS系统基因Ren1,Ren2,Ace,Ace2,Agt,Agtr1a,Agtr1b,Agtr2,及其心血管效应基因Col1a1,Col1a2,Col3 and Ctgf的mRNA相对表达量。3.用含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液提取心肌组织的蛋白质,采用BCA法进行蛋白浓度测定,Western blot技术检测AGTR1,AGTR2,CTGF and COL3蛋白质的相对表达量。结果:1.在3周龄时,IVF组的Ren1,Ace,Agtr1a,Col3和Ctgf的mRNA表达水平显著高于体内组。同样,在10周龄时,IVF组中的Ace,Agt,Agtrlb,Agtr2,Col1al和Col3的mRNA表达水平也明显高于体内组。当达到1.5岁时,IVF组Ren1,Ace,Agtr1b,Col3和Ctgf的mRNA表达水平仍然高于体内组。2.在3周龄时,IVF组AGTR1和CTGF的蛋白表达水平与体内组相比显著增加。10周龄时两组中AGTR1,AGTR2和CTGF蛋白表达水平差异无统计学意义。在老年时,IVF组AGTR1蛋白表达明显上调,但其余蛋白表达水平无显著差异。结论:IVF出生小鼠幼崽期,心肌组织中RAS系统部分基因及其心血管发育和功能调节相关效应基因的表达水平升高,且这种改变可以持续存在,直到老年阶段,提示ART过程可影响出生小鼠心肌组织RAS系统基因表达,并可能是IVF后代心血管畸形或功能障碍的潜在危险因素之一。第二部分体外受精出生小鼠心肌组织肾素-血管紧张素系统表达改变机制研究目的:研究IVF出生小鼠心肌组织中RAS改变的调控机制,阐明IVF作用因素可能影响子代成年后心血管的关键作用环节,探究基因相互作用机制,为降低IVF出生子代的心血管疾病风险研究提供思路和途径。材料及方法:1.使用DNeasy血液和组织试剂盒提取两组小鼠心肌组织中的基因组DNA。对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰,并使用靶向捕获测序技术,检测Col1l1,Ctgf以及印记基因的启动子区域CpG岛的甲基化情况。2.提取小鼠心肌组织中的总RNA,逆转录后,通过miRNA芯片检测老年时期两组小鼠中的miRNA表达谱。3.在芯片筛出的差异miRNA中,聚焦在miRNA数据库预测后分别与Col3a1,Agtr1a和Col1a2相互作用的miRNA:miR-100,miR-297和miR-758作为检测目标。通过定量PCR技术,验证miR-100,miR-297,and miR-758在两组中的表达情况。4.通过构建分别带有AGTR1 3'-UTR或AGTR1 3'-UTR突变片段并将其插入pmiR-RB-Report的荧光素酶报告基因载体,分别转染miR-297a-3pmimic或阴性对照(NC)到293T细胞,检测AGTR1与miR-297的相互作用情况。5.培养H9c2心肌细胞,转染microRNA mimic,在心肌细胞中过表达miR-297。6.细胞转染后48小时,用含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液提取心肌细胞中的蛋白质,采用BCA法进行蛋白浓度测定,Western blot技术检测AGTR1,CTGF和COL3蛋白质的相对表达量。7.细胞转染后48小时,向培养物中加入5-乙炔基-20-脱氧尿苷(EdU)(10μM),并使细胞再生长2小时。分别使用流式细胞术和共聚焦显微镜观察H9c2心肌细胞的增殖情况。结果:1.与体内组相比,IVF组3周时Ctgf的平均DNA甲基化水平显著下降。10周时Ctgf的CpG位点18和Ctgf在老年时期的CpG位点2和14的甲基化水平在IVF组中显著降低。2.在3周龄时,Col1a1的CpG位点4的甲基化水平在IVF组中显著降低。Col1a1在10周时的CpG位点6和8以及Col1a1在老年时期的CpG位点1,2和3的甲基化水平在IVF组中显著降低。3.在3周龄时,两组之间未发现miR-100,miR-297和miR-758的表达水平显著改变。而在第10周,miR-100和在IVF组中观察到miR-758与体内组相比显著升高。在老年时期也有类似的趋势,发现IVF组miR-100,miR-297和miR-758的表达水平显著增加。4.miR-297a-3p模拟物显著调节pmiR-AGTR1-WT载体的萤光素酶活性。然而,pmiR-AGTR1-Mut载体的荧光素酶活性不受miR-297a-3p模拟物的影响。这些结果表明miR-297a-3p直接靶向AGTR1并调节其表达。5.miR-297过表达48 h,后AGTR1和CTGF蛋白表达明显增加,表明miR-297可与AGTR1相互作用,进一步促进CTGF蛋白的表达。6.与对照组相比,miR-297过表达能够显著促进心肌细胞增殖。7.IVF组的Igf2r在1.5年时的平均DNA甲基化水平显著降低;IVF组的Mest在10周时的平均DNA甲基化水平有明显升高;IVF组的Snrpn在3周龄时的平均DNA甲基化水平显著降低。结论:1.IVF出生小鼠心肌细胞Ctgf和Col1a1基因表达水平升高可能是由于其Ctgf和Col1a1基因启动子区CpG位点甲基化水平降低所致。2.miR-100,miR-297和miR-758可能参与了 IVF出生小鼠心肌细胞COL3,AGTR1和COL1表达的调控,且miR-297表达水平改变可能调节心肌细胞增殖活性。3.IVF可能通过改变表观遗传学的调控,导致的IVF出生小鼠RAS表达改变,该机制可能是IVF后代心血管畸形或功能障碍的潜在危险因素。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714
【图文】：

血管系统,调节功能,学说,生殖障碍

第？部分引言逡逑其调节功能改变的倾向［９］，诸如血管收缩压升高、空腹血糖值上升一类成年性心逡逑血管疾病易感因素也已见报道（图１．１）。而ＡＲＴ小鼠模型不仅显示其出生子代存逡逑在血管内皮调节功能和血脂代谢能力的改变［１０，邋１１］，而且显示相关的改变与部分逡逑基因的甲基化修饰改变和表达异常有关。逡逑１９％年Ｂａｒｋｅｒ等提出“成年疾病的胎儿起源学说”，该学说认为成年后的心血管逡逑疾病及糖尿病等一些相关疾病来源于胎儿发育过程中，是机体对体外环境不良刺逡逑激的适应性反应［１２］。现代ＡＲＴ技术通过药物刺激实现多个卵子同步成熟，利用体逡逑外培养和显微操作完成精卵细胞受精结合以及早期胚胎的生长发育，其在消除患逡逑者生殖障碍病因的同时，涉及了生殖细胞增殖、受精、发育乃至分化的多个自然逡逑过程，存在导致配子、受精卵和胚胎发生不良应激的可能性［１３］。受精及胚胎时期，逡逑特别是着床前胚胎

功能图,血管紧张素,功能,血管紧张素原

浆中血管紧张素原（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ，邋Ａｇｔ）水解转化为血管紧张素Ｉ邋（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋Ｉ，逡逑Ａｎｇｌ），然后，通过血管紧张素转化酶（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ，邋ＡＣＥ）将逡逑其水解成Ａｎｇｌｌ－ＩＸ邋（图１．２），使心率加快，血管收缩，心脏输出量增加；加上继逡逑发醛固酮释放，肾小血管血流减少和钠离子重吸收，水钠潴留，进而增加血容量，逡逑维持或升高血压，完成机体的应急反应［１５］。另一方面，在血管壁、心脏等组织也逡逑有广泛活跃的肾素－血管紧张素原合成和分泌，它们以旁分泌和（或）自分泌方式逡逑调节维护心血管的功能和结构［１６］。全身或局部的多种刺激可通过局部的Ｒｅｎ释放，逡逑激活心血管系统的ＲＡＳ系统，导致局部以Ａｎｇｌｌ为主的血管紧张素水平的升高释逡逑放，后者与血管内皮和心肌细胞内具七个跨膜结构域的Ｇ蛋白偶联血管紧张素受逡逑体１型受体（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ邋ｔｙｐｅ邋１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ，邋ＡＴ邋１邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ）结合并活化，调节心血管逡逑细胞的基因表达和功能［１７］。既往研究表明

效应基因,表达水平,肌组织,组分

达水平逡逑使用定量ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＡＳ组分中的基因及其相应的效应基因的表达水平，逡逑以研究ＩＶＦ对子代心肌中与心血管系统健康相关基因表达的影响（图３．１）。在该逡逑研究中检测的ＲＡＳ组分中的基因包括Ｚｃｅ２，邋NB巩和＾／ｒ２。逡逑ＲＡＳ的相应效应基因包括Ｃｏ／ｋｉ，逦Ｃｏ／３和Ｃｆｇ／；在３周龄时，ＩＶＦ组中逡逑ｊｃｅ，邋Ｊｇｒｒ／ａ，邋和Ｃ／ｇ／＂的ｍＲＮＡ表达水平与体内组相比显著增加（１．１４倍，Ｐ逡逑＜０．０５；邋２．１５邋倍，Ｐ〈分别为邋０．０５；邋２．０１邋倍，尸邋＜０．０５；邋１．６２邋倍，Ｐ邋＜０．０５；和邋２．１３邋倍，Ｐ邋＜０．０５邋）逡逑（图邋３．１Ａ）。Ｃｏ／／ａｉ邋和邋Ｃ＜？／７ａ２邋在邋ＩＶＦ邋组和体内组之间的逡逑ｍＲＮＡ表达水平没有观察到显著的统计学差异（尸＞０．０５）（图３．１Ａ）。在１０周逡逑龄时，与体内组相比，ＩＶＦ组中Ｊｃｅ，邋ｄ取Ｃｏ／ｉｆｌ／和Ｃｏ／３的ｍＲＮＡ逡逑表达水平也显著增加（１．７４倍，尸＜０．０５；邋２．０４倍，尸＜０．０５；邋１．７９倍，尸＜０．０５；邋２．０８逡逑倍

【相似文献】