缝隙增强拉曼探针在宫颈癌转移前哨淋巴结中的成像研究

发布时间：2020-08-12 01:50

【摘要】：宫颈癌是全球范围内女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,广泛性全子宫切除加盆腔淋巴结清扫术仍为宫颈癌的常规术式。然而,早期宫颈癌患者的淋巴结转移率低于20%,这说明大多数患者接受了不必要的盆腔淋巴结清扫术,此类手术可能会导致神经损伤、淋巴水肿等并发症的发生,同时也明显降低了患者的生活质量。前哨淋巴结(Sentinel Lymph Node,SLN)是指恶性肿瘤原发灶区域淋巴结发生转移的第一站淋巴结。通过前哨淋巴结活检(Sentinel Lymph Node Biopsy,SLNB)可以判断区域淋巴结的转移状态。前哨淋巴结活检需要利用前哨淋巴结示踪剂和相应的示踪技术以完成对前哨淋巴结的定位,但现有的示踪剂和示踪技术均存在一定缺陷。目前,前哨淋巴结示踪技术仅能做到对前哨淋巴结的定位,尚无法在术中直接评估淋巴结的转移状态。病理诊断仍为评估淋巴结转移的“金标准”,但病理诊断存在非常明显的时间局限性。因此,开发一种新的前哨淋巴结示踪剂和示踪技术,克服现有技术的不足,并在此基础上制备一种具有主动识别宫颈癌转移前哨淋巴结的特异性示踪剂,能在术中示踪前哨淋巴结的同时实现对宫颈癌前哨淋巴结转移状态的评估,将具有非常重大的临床意义。叶酸受体α(Folate receptorα,FRα)是在多种恶性肿瘤细胞表面高表达的膜受体,肿瘤细胞通过大量摄取叶酸以满足自身快速增殖的需求。叶酸分子通过与FRα的结合,可以增强对肿瘤细胞的靶向性。因此,制备叶酸修饰的前哨淋巴结示踪剂有望实现宫颈癌术中对转移前哨淋巴结的特异性示踪。表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是指由于表面等离激元的激发以及表面化学效应使得吸附在金属纳米结构表面的分子的拉曼散射产生极大的增强效应,可实现单颗粒检测,具有非常高的灵敏性。此外,其特有的指纹式图谱使其具有超高的特异性,超窄的半宽峰有利于光学编码的多指标检测,且光学稳定性强,不存在荧光淬灭的问题。基于以上这些突出的优势,SERS纳米探针在生物医学领域具有非常广阔的应用前景。因此,SERS纳米探针以及拉曼成像技术非常有希望成为一种新型的前哨淋巴结示踪剂和示踪技术。本论文共分为三部分:(1)缝隙增强拉曼探针的制备及其在前哨淋巴结中的成像研究;(2)叶酸受体α在宫颈癌中的表达及叶酸修饰的靶向性缝隙增强拉曼探针的制备;(3)叶酸修饰的靶向性缝隙增强拉曼探针在宫颈癌细胞及宫颈癌转移淋巴结动物模型中的靶向成像研究。研究目的:1、探讨缝隙增强拉曼探针(Gap-Enhanced Raman Tags,GERTs)的制备以及利用该探针作为前哨淋巴结示踪剂,研究其示踪前哨淋巴结的效果;2、探讨宫颈癌组织和细胞株中叶酸受体α(FRα)的表达水平,并以FRα的特异性配体叶酸分子(FA)为修饰材料,制备FA修饰的新一代主动靶向性缝隙增强拉曼探针;3、探讨FA修饰的靶向性缝隙增强拉曼探针(FA-GERTs)对宫颈癌细胞株的靶向作用,并研究其在宫颈癌转移前哨淋巴结动物模型中的靶向成像效果。研究方法:1、通过“标记物包埋法”制备一种新型的介孔硅包被的缝隙增强拉曼探针(MS-GERTs),通过透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)激光粒度仪、紫外可见分光光度计(UV-Vis)对MS-GERTs探针进行形貌、粒径、电位及光学属性的表征,通过拉曼光谱检测分析探针的拉曼信号强度、光学稳定性以及检测敏感性;2、通过动物足部爪垫注射方式,观察不同时间点(0.5 h,2 h,4 h,8 h,24 h)前哨淋巴结内探针的分布,利用3D拉曼成像技术明确探针进入前哨淋巴结的动态过程;3、通过qVRI拉曼光谱数据处理软件统计分析淋巴结内多种组分含量占比,迅速完成高对比度的3D拉曼图像,通过原子吸收测定不同时间点淋巴结内探针含量;4、运用商业化便携式拉曼探测仪对活体内前哨淋巴结进行示踪;5、通过CCK-8实验分析探针的细胞学毒性,通过动物活体实验分析探针的生物相容性;6、免疫组化方法检测宫颈癌组织和正常宫颈组织中FRα的表达差异及其与临床病理资料的相关性;7、通过Real-time PCR检测宫颈癌细胞株内FRαmRNA的表达水平,通过Western Blot方法检测宫颈癌细胞株内总FRα的表达,通过流式细胞技术检测宫颈癌细胞表面FRα的表达;8、通过“标记物包埋法”包埋另一种拉曼信号分子NBT,制备新一代GERTs探针,通过DMF和丁二酸酐与GERTs表面的胺基进行酰胺化反应,将颗粒表面修饰成羧基基团,再通过EDC和NHS活化颗粒表面羧基,通过酰胺化反应共价偶联FA分子,制备FA修饰的靶向性缝隙增强拉曼探针(FA-MS-NBT-GERTs),通过透射电镜、紫外可见分光光度计(UV-Vis)表征FA-MS-NBT-GERTs探针的形貌、大小以及颗粒分散性,动态光散射激光粒度仪检测其粒径分布及Zeta电位,通过拉曼光谱检测分析探针的拉曼特征峰位及拉曼信号强度;9、通过拉曼成像技术测定FA-MS-NBT-GERTs探针对FRα高表达的宫颈癌细胞株HeLa细胞的靶向作用;10、通过CCK-8实验检测FA-MS-NBT-GERTs的细胞毒性,通过动物体内实验分析其生物相容性;11、通过后足爪垫注射GFP-Luc-HeLa稳转细胞株,皮下成瘤后自发形成前哨淋巴结转移,通过BLI动物发光成像确定淋巴结转移,建立宫颈癌前哨淋巴结转移模型,通过局部注射两种相同浓度、相同剂量的靶向性(FA-GERTs)和非靶向性探针(Nt-GERTs)的混合液,实现在动物体内前哨淋巴结3D成像;12、通过机器学习法中的经典最小二乘法(CLS)对拉曼光谱数据集进行分峰处理,计算两种探针的比值,判断前哨淋巴结是否转移;13、通过病理切片HE染色和CK免疫组化方法验证该基于FA-GERTs/Nt-GERTs比值预测模型的主动靶向性成像技术在诊断前哨淋巴结转移中的准确性。研究结果:1、成功制备了介孔硅包被的缝隙增强拉曼探针MS-GERTs,其结构包括核壳结构的金纳米颗粒、缝隙区域内嵌拉曼分子BDT以及最外层的介孔硅。该探针外观呈球形或椭圆形,平均粒径82±4 nm,平均电位+20.1 mV,紫外最大吸收波长位于545 nm;MS-GERTs探针内嵌的拉曼信号分子(1,4-BDT)所产生的特征峰位于732,1055,1177和1555 cm~(-1),经激光连续照射30 min,探针的拉曼信号强度几乎没有衰减,提示MS-GERTs探针具有超强的光学稳定性。MS-GERTs探针最低检测限为100 fM,提示探针超高的敏感性。2、动物体内前哨淋巴结示踪实验结果显示,MS-GERTs探针经爪垫皮下注射后2h～24h可精确定位前哨淋巴结,而不进入下一级淋巴结,提示MS-GERTs探针在动力学方面十分符合理想SLN示踪剂的标准。3、经qVRI拉曼光谱数据处理软件分析可以迅速区分淋巴结组织、MS-GERTs探针以及背景信号,并计算每种成分的占比,其所得的淋巴结内探针含量与原子吸收测定相比,结果具有相同的趋势,表明qVRI数据处理模式可以准确迅速计算淋巴结内探针含量。4、手持式拉曼探测仪在活体动物体内成功实现了对前哨淋巴结的实时定位,提示MS-GERTs探针和拉曼光谱技术具有转化临床的潜力。5、细胞学毒性实验结果显示不同浓度的探针对人正常肝细胞L-O2及人正常肾小管上皮细胞HK-2的存活率影响非常小,表明探针在细胞层面没有明显的毒性作用。动物体内生物安全性实验结果显示对照组与MS-GERTs探针组小鼠的体重、肝肾功能指标的差异均无统计学意义,主要脏器的病理切片均未见明显的形态学改变,说明MS-GERTs探针具有良好的生物安全性。6、在临床手术中切除的宫颈癌石蜡标本中,FRα的表达与肿瘤分期和组织学分级呈正相关,但与宫颈癌病理类型无明显相关性,宫颈癌组织中FRα的表达较正常宫颈组织明显升高(P0.001)。7、宫颈癌细胞中,Real-time PCR结果显示HeLa细胞中FRαmRNA过表达,SiHa、CaSki和C33A细胞也均存在FRαmRNA的表达;在总蛋白水平,Western Blot结果显示HeLa细胞内FRα表达量与FRα高表达阳性对照KB细胞相比,结果相近,两种细胞均存在FRα高表达,而SiHa、CaSki和C33A细胞表达较弱;流式细胞技术结果提示HeLa细胞表面高表达FRα,SiHa、CaSki和C33A细胞均有表达,但表达量相对较低。8、确定宫颈癌细胞过表达FRα后,基于其特异性配体FA分子,功制备了FA分子修饰的内嵌NBT拉曼信号分子的新一代GERTs探针(FA-MS-NBT-GERTs),该探针的核壳结构呈花瓣状,外层包被一层介孔硅,各花瓣分枝间可见明显的缝隙结构,其粒径大小约83±6 nm,电镜下可见颗粒分散性好,颗粒大小均一;动态光散射粒度仪检测水力学直径为147.6±1.11 nm,Zeta电位为(-24.6±0.6)mV;UV-Vis显示在280nm波长处有明显的FA分子吸收峰,提示FA成功修饰于GERTs探针上;拉曼光谱检测FA-MS-NBT-GERTs颗粒的特征峰位于1078,1339及1568cm~(-1)处;该新一代NBT-GERTs探针的拉曼信号强度可随NBT吸附时间的改变而改变,拉曼信号可调控。9、细胞靶向实验结果显示,HeLa细胞对FA-MS-NBT-GERTs的摄取率显著高于无主动靶向效果的MS-NBT-GERTs和MS-BDT-GERTs,FRα高表达的HeLa细胞对FA-MS-NBT-GERTs的摄取率明显高于FRα阴性表达的A549细胞,且经游离FA预处理的HeLa细胞对FA-MS-NBT-GERTs的摄取明显下降,提示游离FA能竞争性抑制FRα受体高表达的HeLa细胞对靶向性探针的摄取。10、CCK-8实验提示FA-MS-NBT-GERTs未见明显细胞毒性,动物体内生物安全性评估结果显示,注射FA-MS-NBT-GERTs颗粒后的24 h、7 d、14 d、28 d,其肝肾功能与正常对照组相比均无统计学差异,主要脏器均未见明显组织学病理改变,提示FA-MS-NBT-GERTs探针具有良好的生物相容性。11、宫颈癌淋巴结转移动物模型体内实验显示,对照组前哨淋巴结内FA-GERTs/Nt-GERTs的比值为1.07±0.26,提示两种探针的非特异性摄取率基本相同,反应性增生SLN组FA-GERTs/Nt-GERTs为1.15±0.15,与正常SLN组的比值相比,差异无统计学意义(P0.05),转移SLN组前哨淋巴结内FA-GERTs/Nt-GERTs为2.29±1.03,与正常对照组相比差异具有统计学意义(P0.01),提示FA-GERTs较多被前哨淋巴结内的肿瘤细胞摄取。12、病理切片证实转移SLN内存在肿瘤转移灶。结论:1、MS-GERTs探针具有合适的粒径大小,超强的信号敏感性及特异性,超高的光学稳定性,良好的生物相容性,是一种理想的前哨淋巴结示踪剂。2、手持式拉曼探测仪能在术中实现前哨淋巴结的实时定位,提示拉曼光谱技术极有可能成为一种新型的前哨淋巴结示踪技术,具有非常大的临床转化潜力。3、FRα在正常宫颈中不表达或低表达,在宫颈癌中高表达,与肿瘤分期和组织学分级呈正相关,与宫颈癌的病理学类型无明显相关性,鳞癌、腺癌及特殊类型宫颈癌组织中均存在FRα的表达。4、FRα可以作为宫颈癌靶向成像的一个理想靶点,FA分子是FRα的特异性配体,可作为主动靶向性探针的表面修饰分子。5、内嵌NBT拉曼信号分子的新一代GERTs探针,其拉曼信号强度可以调控,是一种性能更加优越的第二代GERTs探针。成功制备了FA修饰的内嵌NBT分子的新一代GERTs探针(FA-MS-NBT-GERTs)。6、FA-MS-NBT-GERTs是一种具有主动靶向宫颈癌细胞能力的探针,细胞靶向实验效果明显。7、利用FA-GERTs/Nt-GERTs比值预测模型,进行宫颈癌前哨淋巴结的3D拉曼成像,可以初步实现对转移前哨淋巴结的特异性成像。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33
【图文】：

前哨淋巴结,表面增强拉曼,成像技术,表面增强拉曼光谱

腺癌、胰腺癌等术中的精准成像，其研究成果发表于Nature Medicine及Scieranslational Medicine上[30,31]（见图 1c）。另有研究者术中使用便携式手持拉曼仪，可发现肉眼不可见的微小残留肿瘤病灶[32]（见图 1d）。目前，SERS纳米作为肿瘤成像技术已得到了极大关注，但其在显影前哨淋巴结中的研究几乎。目前的化学合成制备方法使得结合了金属纳米颗粒和拉曼标记分子的现ERS纳米探针具有以下优点：（1）20～200nm的颗粒大小；（2）拉曼增强性，可引入独特的生物体本身所不具有的拉曼标记分子，不受生物体背景拉曼干扰；（3）亚微米级的光学空间分辨率；（4）低毒性。同时，目前商业化的检测仪器既可以利用其显微系统实现组织水平的生物成像，也可以利用其便（或手持式）系统实现快速定位。以上这些特点都使得现有的SERS探针非常用于示踪SLN，有望成为理想的SLN示踪剂。

示意图,纳米颗粒,路线,示意图

上海交通大学医学院 2018 届博士研究生学位论文第一部分3 结果3.1 MS-GERTs 纳米颗粒的表征MS-GERTs 纳米颗粒的合成路线如图 2 所示，通过种子生长法制备获得金核，1,4-BDT 拉曼信号分子通过 Au-S 键吸附于金核表面，外层继续生长金壳层，获得核壳结构的金纳米颗粒 Au@BDT@Au，最后在外层包被一层介孔硅。

谱线,中比例尺,纳米颗粒,红色

Ts 纳米颗粒的 TEM 图，红色箭头表示金核与金壳图中比例尺为 50 nm。e of MS-GERTs particles, red arrows indicate the gapandAu shell, the scale bar is 50 nm.谱表征，可以发现金核在 520nm 有明显的局acePlasmonResonance,LSPR）峰，如图 4a 中于金核表面部分 CTAC 分子被 BDT 所取代移，如图 4a 中红色谱线所示；图 4b 中可见R 峰位于 540nm 处，最后完成介孔硅修饰后约 5nm。MS-GERTs 分散在水溶液中时呈现）。

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