抑凋亡蛋白TNFAIP8影响子宫颈癌细胞生物功能的初步探究

发布时间：2020-08-12 03:21

【摘要】：研究背景和意义子宫颈癌(cervical cancer)是常见的女性恶性肿瘤,其全球发病率仅次于乳腺癌,近年来子宫颈癌的发病呈现年轻化的趋势,严重威胁女性的健康和生命。现有的预防治疗手段中,宫颈癌的疫苗已经上市可以进行早期预防,手术切除、放疗和辅助化疗等治疗方式也取得了巨大的进步。然而有很多患者被发现时已经处于中、晚期,原本有效的治疗方法变得效果不佳或无效。因此,迫切需要探索一种有效的肿瘤标志物用于早期诊断及改进治疗策略。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(TNFAIP8或TIPE)是最近发现的一种癌基因,也被称做GG2-1,SCC-S2,MDC-3.13。TIPE在多种癌症中高表达,并且参与了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制了肿瘤细胞的凋亡以及降低了肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。有研究表明,在女性肿瘤中,TIPE高表达于子宫内膜癌,并且在子宫内膜癌的发展中TIPE还与基质金属蛋白酶-9及增殖性抗原Ki-67的表达高度相关。在卵巢癌中,TIPE与肿瘤的临床病理特征和预后有一定相关性,但其在子宫颈癌中的表达和参与调节子宫颈细胞的生长、侵袭及迁移的机制尚未确定。所以研究TIPE对子宫颈癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响及确切的机制,发现和找出一个新的干预靶点,对子宫颈癌的治疗和改善病人预后有着重要的意义。研究目的探讨TIPE对子宫颈癌细胞的增殖、浸润、转移及凋亡的影响及相关机制,为子宫颈癌的早期临床诊断和靶向治疗提供依据。研究方法运用免疫组化技术测定临床病例的癌组织和癌旁组织中TIPE的表达量,分析TIPE在癌组织和癌旁组织中的表达差异。敲除HeLa、C-33A、SiHa三种子宫颈癌细胞中的TIPE基因,通过嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株。运用MTS实验技术检测TIPE对子宫颈癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验与Transwell实验分析TIPE对子宫颈癌细胞迁移能力的影响;用Matrigel实验分析TIPE对子宫颈癌细胞侵袭能力的影响;通过TUNEL实验和流式细胞术检测TIPE对子宫颈癌细胞凋亡能力的影响;Western Blot检测TNFR1受体信号通路中相关凋亡蛋白的表达。建立荷瘤小鼠模型,分析敲低TIPE对子宫颈癌细胞在裸鼠体内成瘤的影响。结果免疫组化测定结果显示,子宫颈的癌旁组织中TIPE表达水平低于癌组织。敲低子宫颈癌HeLa、C-33A、SiHa细胞系中TIPE的表达,MTS结果显示敲低组细胞增殖能力显著低于对照组细胞;从划痕、Transwell、Matrigel的实验结果以及结合相关侵袭蛋白MMP2、MMP9的检测水平,可以看出敲低TIPE能够明显降低子宫颈癌细胞HeLa、C-33A、SiHa的迁移、侵袭能力;TUNEL实验和流式检测结果显示,敲除TIPE的子宫颈癌细胞的抗凋亡能力低于对照组细胞。此外,Western Blot结果显示,TNFR1通路中调控凋亡的相关蛋白如FADD、casepase3、casepase9、p-JNK、Bax等蛋白表达增加;SiHa细胞在裸鼠皮下成瘤显示敲低TNFAIP8降低了裸鼠瘤体的生长速度和瘤体的大小。结论肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8(TIPE)促进子宫颈癌细胞的增殖、浸润转移,抑制其凋亡。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33
【图文】：

标准曲线,标准曲线,蛋白

图 3-1 标准曲线曲线，计算每个样品的蛋白浓度。交法验证敲低 TIPE品：根据测得浓度，构建所需体系：向蛋白样加入 5×S，使所有蛋白样品终浓度都一致并且使 Loading Buffer 水中煮 10-15min，置于冰上备用或于-20℃。：根据需要制聚丙烯酰胺凝胶，选择合适浓度的胶（注水封，避免气泡），插梳子备用。胶凝后，按顺序加入蛋白er 用 1×Loading Buffer 按量补齐。调 80V，电泳 30 min，再 150V，电泳约 120 min（具体去浓缩凝胶，溴酚蓝及不用部分的胶，剩余所需部分置于

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4 结果4 结果4.1 TIPE 在子宫颈癌组织中的表达高于癌旁组织免疫组化技术检测 40 例癌及癌旁组织子宫颈癌中 TIPE 的表达量。结果显示，我们发现癌与癌旁组织均有不同程度的 TIPE 表达，癌组织的表达高于癌旁（图 1A）；将组织中的 TIPE 的表达量按阴性、低表达、表达、高表达分别分为 4 个等级，即 0、1、23。不同病人组织的 TIPE 表达量不同（图 1B）。

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图 2.RT-PCR 和 Western blot 检测子宫颈癌敲低组和对照组细胞中 TIPE 的表达。4.3 敲低 TIPE 降低子宫颈癌细胞的增殖能力MTS 实验结果显示，敲低 TIPE 在 SiHa,HeLa 和 C-33A 细胞中的表达后，敲低组细胞增殖能力明显降低，尤其以 SiHa 和 HeLa 细胞较为明显。SiHa 细胞的对照组 NegshRNA 从第三天开始增殖较敲低组明显，结果有显著差异（p＜0.05）；HeLa 细胞的对照组 Neg shRNA48 小时以后增殖较 TNFAIP8 shRNA 明显，p＜0.05，结果有显著差异；而 C-33A 细胞的对照组 Neg shRNA 和敲低组 TNFAIP8 shRNA 之间的差异不太显著，在第一天到第四天几乎没有差异，到第五天对照组才比敲低组增殖生长快（图 3）。

【参考文献】