Rad21基因干扰对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其致癌机制的研究

发布时间：2020-08-15 18:10

【摘要】：引言子宫颈癌是世界范围内影响妇女健康的一种最常见妇科恶性肿瘤,虽然早期筛查和治疗降低了宫颈癌的发病率和死亡率,但对于许多发展中国家,宫颈癌仍是威胁妇女生命的常见妇科疾病。Rad21基因是Cohesin的一个亚单位,其主要作用是保持姐妹染色单体的粘合与分离,调控其他基因转录,以及在DNA损伤修复过程中起作用等。已有很多研究表明Rad21基因在多种肿瘤中过表达,我们前期研究发现Rad21在宫颈癌组织中表达强度和mRNA表达水平显著高于正常宫颈组织,Rad21基因位点多态性与汉族妇女宫颈癌的发生有关,提示Rad21可能在宫颈癌的发生发展中起着一定的作用。本研究采用慢病毒感染宫颈癌细胞的方法,观察降调Rad21表达后对宫颈癌细胞生物学行为及放疗敏感性的影响,生物信息学工具分析Rad21在宫颈癌中的作用及可能的致癌机制,并运用裸鼠宫颈癌模型观察降调Rad21表达后对移植瘤的影响,探索Rad21基因促进宫颈癌发生的可能机制。第一部分 干扰Rad21基因对宫颈癌细胞生物学行为及放疗敏感性的研究目的研究Rad21基因干扰后对宫颈癌细胞生物学行为及放疗敏感性的影响。方法1.细胞免疫化学和Western Blot(蛋白印迹)方法检测Rad21基因在宫颈癌HeLa和Siha细胞中蛋白的表达。2.四个Rad21慢病毒干扰质粒、一个阴性对照质粒用脂质体法转染到293T细胞中进行包装。3.慢病毒感染HeLa和Siha细胞及Puromycin筛选,FQ-PCR和Western Blot方法检测四条Rad21 shRNA的干扰效率,选出干扰效率最好的慢病毒干扰质粒用于后续实验。4.CCK-8法检测Rad21 shRNA感染前后HeLa和Siha细胞增殖能力的变化。5.划痕实验和Transwell迁移实验观察Rad21 shRNA感染前后HeLa和Siha细胞迁移和侵袭能力的改变。6.流式细胞仪检测Rad21shRNA感染前后HeLa和Siha细胞的凋亡能力和细胞周期的变化。7.集落形成(Colony)技术检测HeLa和Siha细胞的存活率。观察稳定感染Rad21shRNA后HeLa和Siha细胞对γ射线敏感性的变化。结果1.Rad21在宫颈癌HeLa和Siha细胞中均有表达,且HeLa较Siha细胞中Rad21蛋白表达水平稍高。2.四条慢病毒干扰质粒除TL309968A外,其余均有干扰效果,HeLa细胞中TL309968B干扰效果最佳,Siha细胞中TL309968C干扰效果最佳,干扰效率均在60%以上。3.干扰Rad21基因表达后,抑制了宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,诱导凋亡,使细胞阻滞在G2/M期,增加放疗的敏感性。小结1.Rad21在宫颈癌细胞系HeLa和Siha细胞中均有表达。2.Rad21参与了宫颈癌细胞的增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭等恶性生物学行为,说明Rad21在宫颈癌的发生过程中有着重要作用,与宫颈癌发生发展的分子生物学机制密切相关。3.应用慢病毒感染干扰Rad21基因表达后,增加了宫颈癌细胞对放疗的敏感性,这对应用慢病毒感染干扰Rad21基因表达治疗子宫颈癌提供了理论依据。第二部分TCGA数据库挖掘Rad21基因在宫颈癌中的作用机制目的探讨Rad21基因在宫颈癌中可能的致癌机制。方法1.TCGA数据库下载306例宫颈癌患者的临床数据,根据患者Rad21基因表达水平分为高,中、低三组,进行Kaplan Meier生存分析,探讨Rad21基因与患者预后的关系。2.生物信息学工具分析Rad21基因在宫颈癌中的作用及表达相关基因,寻找Rad21基因可能的致癌机制。3.质粒转染上调和慢病毒感染下调宫颈癌HeLa细胞中Rad21基因的表达,FQ-PCR和Western Blot方法检测XPO1(核输出蛋白1)、P53及细胞周期相关基因mRNA和蛋白的表达。结果1.Rad21高表达组总生存时间明显低于低表达组,随着临床期别增高,Rad21的表达逐渐升高,但无显著性差异。2.GO(Gene ontology)结果显示Rad21位于染色体着丝粒部位、核染色质和cohesin复合体内,能够与染色质结合,具有DNA依赖性ATP酶活性,在DNA重组、双链断裂修复及有丝分裂姐妹染色单体聚合、分离中起作用。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)结果显示宫颈癌中 Rad21 主要在细胞周期和RNA转运方面发挥作用。3.STRING(检索基因/蛋白质相互作用的检索工具)结果显示Rad21和XPO1之间存在蛋白质相互作用关系。4.干扰Rad21表达后,XPO1、CyclinB1及CDK1的表达降低,而P21、P27及抑癌基因P53表达升高;反之,Rad21表达升高后,XPO1、CyclinB1和CDK1表达升高,而P21、P27及抑癌基因P53表达降低。小结1.Rad21高表达的患者存活时间比Rad21低表达的患者生存时间缩短。2.Rad21和XPO1的RNA核转运之间有着密切的功能关系。3.Rad21基因可能是通过参与细胞周期调控和XPO1对抑癌基因的核输出而促进宫颈癌的发生发展。第三部分下调Rad21蛋白表达对子宫颈癌裸鼠移植瘤生长及侵袭的作用目的探讨下调Rad21蛋白对裸鼠宫颈癌移植瘤生长的作用,并进一步研究其对抑制瘤增殖、凋亡的影响,为以Rad21基因为靶点的子宫颈癌治疗提供新的依据。方法1.构建人宫颈癌HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤模型。2.记录裸鼠的生长曲线及死亡状况,于第30d脱颈椎处死裸鼠,剥离肿瘤,测量肿瘤的大小并取材拍照。3.免疫组化SP法检测两组裸鼠移植瘤组织中增殖细胞核抗原(PCNA)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的表达。4.TUNEL法检测移植瘤组织细胞的凋亡。5.Western Blot方法检测各组移植瘤组织中Rad21及相关基因的蛋白表达。结果1.成功构建移植瘤裸鼠模型,成瘤率100%。2.自接种后第9天起肿瘤体积Rad21干扰组裸鼠明显小于对照组,差异有统计学意义(P0.05),且显著性差异持续存在,直至实验结束。3.免疫组化SP法检测显示,实验组移植瘤细胞中PCNA和VEGFR-2的阳性细胞数目明显减少,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。TUNEL法检测显示,与对照组相比,Rad21干扰组中细胞的凋亡指数明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。4.稳定干扰Rad21表达后,XPO1、CyclinB1和CDK1蛋白表达降低,而P21、P27及抑癌基因P53蛋白表达升高。小结1.应用HeLa细胞裸鼠皮下接种可成功构建裸鼠宫颈癌移植瘤模型。2.干扰HeLa细胞中Rad21蛋白表达后,能够抑制裸鼠宫颈癌移植瘤的生长,使移植瘤的增殖和新生血管生成降低,细胞的凋亡增加。3.Rad21基因可能通过细胞周期调控和XPO1的核输出功能参与宫颈癌的发展。结论1.在宫颈癌HeLa和Siha细胞中,干扰Rad21基因抑制了宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,诱导凋亡,使细胞阻滞在G2/M期,对放疗的敏感性增加。2.Rad21高表达的宫颈癌患者存活时间比Rad21低表达的患者生存时间缩短。3.干扰Rad21蛋白表达后,能够抑制裸鼠宫颈癌移植瘤的生长,使移植瘤的增殖和新生血管生成降低,细胞的凋亡增加。4.Rad21和XPO1的RNA核转运之间有着密切的功能关系,Rad21基因可能通过细胞周期调控和XPO1对抑癌基因的核输出而促进宫颈癌的发生发展。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33
【图文】：

ａｄ２１ｍＲＮＡ和蛋白的表达，４条慢病毒干扰质粒除ＴＬ３０９９６８Ａ外，其余均有干逡逑扰效果，ＨｅＬａ细胞中ＴＬ３０９９６８Ｂ干扰效果最佳，Ｓｉｈａ细胞中ＴＬ３０９９６８Ｃ干扰逡逑效果最佳，干扰效率在６０％以上。如图１．３、图１．４。筛选出的干扰质粒用于后逡逑续的生物学行为研究。逡逑［＞？ｓｏｃ？ａｌｗｎ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑ａ逦Ｒｏ邋ｖｔＣｙｃ＾ｅ逡逑２１逡逑

Ｈｉ逡逑ＨｅＬａ逦Ｓｉｈａ逡逑图１．２邋Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ在宫颈癌细胞系ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ中的感染效果。（Ｘ丨00）。逡逑４．４邋Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ慢病毒感染可下调ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ细胞中Ｒａｄ２１逡逑的表达逡逑利用慢病毒介导的ＲＮＡｉ技术，包装含Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ和阴性对照的慢病毒逡逑颗粒，并用其感染ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ细胞，经Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ筛选后构建Ｒａｄ２１基因下逡逑调的细胞株。提取各组细胞总ＲＮＡ和蛋白，ＦＱ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法检测Ｒ逡逑ａｄ２１ｍＲＮＡ和蛋白的表达，４条慢病毒干扰质粒除ＴＬ３０９９６８Ａ外，其余均有干逡逑扰效果，ＨｅＬａ细胞中ＴＬ３０９９６８Ｂ干扰效果最佳，Ｓｉｈａ细胞中ＴＬ３０９９６８Ｃ干扰逡逑效果最佳，干扰效率在６０％以上。如图１．３、图１．４。筛选出的干扰质粒用于后逡逑续的生物学行为研究。逡逑［＞？ｓｏｃ？ａｌｗｎ邋Ｃｕｒｖｅ逡逑ａ逦Ｒｏ邋ｖｔＣｙｃ＾ｅ逡逑２１逡逑

用ＣＣＫ－８法检测干扰组Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ、阴性对照组Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ和空白逡逑组Ｃｏｎｔｒｏｌ细胞接种后第１－４天各组细胞的吸光度值（０Ｄ值）。见表１．４。以培养逡逑时间为横坐标，测得的０Ｄ值为纵坐标绘制细胞生长曲线。图１．５。结果表明，逡逑Ｒａｄ２１干扰组的ＨｅＬａ和Ｓｉｈａ细胞较对照组细胞增殖能力明显下降（Ｐ＜０．０５），接逡逑种当天和接种后第一天无明显改变（Ｐ＞０．０５）。逡逑表丨．４邋Ｒａｄ２１ｓｈＲＮＡ对ＨｅＬａ、Ｓｉｈａ干扰后各组细胞不同时间的光密度值（０Ｄ值NB义士＾）逡逑分组逦Ｏｈ逦２４ｈ逦４８ｈ逦７２ｈ逦９６ｈ逦尸值逦／Ｍ直逡逑ＨｅＬａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦０．１９４±０．０３０逦０．３９５±０．０１８逦０．６９５±０．０１３逦０．９２５±０．０７７逦Ｉ．０７４±０．０７０逦１６２．６０２逦＜０．００１逡逑Ｎｅｇａｔｉｖｅ逦０．１９０±０．０２９逦０．３７７±０．０２４逦０．６４１邋±０．０４３逦０．８８１±０．０５９逦１．０３２±０．０４０逦２１８．２０８逦＜０．００１逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ＴＬ３０９９６８Ｂ＊＊逦０．１８３±０．０２１逦０．３５４±０．０３６逦０．３９８±０．０３４逦０．５５９±０．０３８逦０．６３６±０．０２５逦９５．３２８逦＜０．００１逡逑厂值逦０．１２８逦１．６７５逦７０．６５３逦３３．００６逦７４．１７０逡逑尸值逦０．８８２逦０．２６４逦＜０．００１逦０．００１逦＜０．００１逡逑Ｓｉｈａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋０．１８８±０．０６０邋０．４５６±０．０９３邋０．６５４±０．０６１逦０．８９０±０．１００逦１

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