IC-N-miR-20对宫颈癌细胞恶性行为的调控及机制研究

发布时间：2020-08-17 21:20

【摘要】：【目的】宫颈癌(cervical cancer,CC)是女性最常见的恶性肿瘤之一,其主要发生于发展中国家,死亡率较高。研究表明CC的发生发展主要与人乳头瘤病毒(HPV)感染相关。与此同时,大量研究证明慢性非可控性炎症的持续性存在可以在启动、维持、促进肿瘤的发生过程中发挥重要作用。慢性非可控性炎症不仅可以促进肿瘤发生,也可以参与肿瘤进展、免疫逃逸、血管生成和转移过程。目前,炎症引起恶性肿瘤发生的分子机制尚未完全清楚。众所周知,微小RNA(micro RNA,mi RNA)主要在基因转录后水平调控基因表达,并影响疾病进展。为了探究mi RNA、炎症和CC发生发展之间的关系,我们对经肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-Cd R)联合处理以及未经处理的He La细胞进行深度测序分析,从中选取了表达明显升高的新mi RNA(命名为IC-N-mi R-20)进行后续研究。本研究目的在于探究IC-N-mi R-20对宫颈癌恶性行为的影响及其作用机制,以期为宫颈癌的发现、诊断以及治疗提供新的思路。【方法】首先,我们根据深度测序结果选取了表达差异较大的10个mi RNA,并运用RT-q PCR对TNF-α和5-Aza-Cd R联合处理后的He La细胞中mi RNA的表达情况进行验证。接着,在He La细胞中瞬时转染Dicer和Drosha敲降质粒,通过RT-q PCR进一步验证IC-N-mi R-20的形成是否依赖于经典的mi RNA形成途径。然后,应用集落形成实验、MTT实验、Transwell迁移和侵袭实验以及Western blot探究了IC-N-mi R-20对宫颈癌恶性行为及上皮间质转化进程(EMT)的影响。之后,利用Target Scan Human 5.2 Custom预测IC-N-mi R-20的靶基因,使用EGFP荧光报告实验验证IC-N-mi R-20与靶基因之间的关系,并结合RT-q PCR和Western blot分别从m RNA水平和蛋白质水平验证IC-N-mi R-20对靶基因的调控作用。最后,利用细胞功能学实验对靶基因的功能进行验证;应用挽救实验验证IC-N-mi R-20是否通过直接调控靶基因的表达发挥对宫颈癌细胞恶性行为的调控作用。【结果】RT-q PCR结果表明TNF-α和5-Aza-Cd R联合处理后IC-N-mi R-20表达升高,且其生成依赖于经典的mi RNA生成途径。细胞功能学实验表明在He La和Si Ha细胞中过表达IC-N-mi R-20能够促进其集落形成能力和迁移/侵袭能力,Western blot结果表明IC-N-mi R-20能够下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达,从而促进EMT进程,这意味着IC-N-mi R-20在宫颈癌中作为一个促癌基因发挥作用。生物信息学预测发现IC-N-mi R-20在SOCS6 3’UTR具有潜在结合位点。EGFP荧光报告实验结果确证了IC-N-mi R-20能够直接靶定SOCS6,同时RT-q PCR和Western blot结果证明IC-N-mi R-20能够从m RNA水平和蛋白质水平负调控SOCS6的表达。而SOCS6对宫颈癌细胞集落形成能力、迁移/侵袭能力以及EMT进程起抑制作用,与IC-N-mi R-20的功能相反。最后,IC-N-mi R-20与靶基因的挽救实验进一步验证了IC-N-mi R-20促进宫颈癌细胞恶性行为是通过负调控靶基因SOCS6实现的。【结论】本实验研究并证实了IC-N-mi R-20通过负调控SOCS6基因来促进宫颈癌细胞集落形成、迁移和侵袭,并且IC-N-mi R-20对SOCS6基因的负调控作用促进了宫颈癌EMT进程,最终从下游分子途径解释了IC-N-mi R-20调控宫颈癌细胞恶性行为的作用机制,同时也可能为宫颈癌的诊断和治疗提供新的分子基础。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

分布情况,差异表达,火山,靶基因

图 1-1 S01 和 S04 组 miRNA 差异表达火山图的点表示每一个被检测到的 miRNA，横坐标则表示该 miRNA 在两样品中表的对数值，横坐标绝对值越大，说明该 miRNA 在两样品间的表达量差异倍数越无处理组，S04 表示 TNF-α 和 5-Aza-CdR 联合处理组。GO 和 KEGG 软件分析呈差异性表达的 miRNA 靶基因的分布情况先我们对呈差异性表达的 miRNAs 的靶基因按照功能进行 GO 分类，分为与生物学过程，细胞组分和分子功能相关的三类，如图 1-2A 所数据库被用来分析这些靶基因分别存在于哪些已知通路中，并通过统计算这些基因的变化与哪些通路最为相关，结果显示这些靶基因与物及肿瘤相关信号通路具有一定的相关性，如图 1-2 B 所示。

差异表达,联合处理

天津医科大学硕士学位论文呈差异表达的 miRNA 靶基因进行 GO 分类分析 (A)，和 KEGG 分析 (B)。.2.3 RT-qPCR 验证 miRNAs 的差异表达为了进一步确定 miRNAs 差异表达的稳定性和准确性，我们按照上述制法重新制备了一批新的 RNA 样品。同时，选取差异表达倍数较高的 10 iRNAs，使用 RT-qPCR 检测这些 miRNAs 的表达情况。如图 1-3 所示，新 miRNAnconservative_11_146640（将其命名为 IC-N-miR-20）的表达明显升高，与深序结果一致，并且其表达差异具有统计学意义。

过程图,过程,信息学,软件预测

天津医科大学硕士学位论文信息学软件预测的 IC-N-miR-20 前体结构和序列（A），以及C-N-miR-20 的形成过程iR-20 作为一个新的 miRNA，为了进一步验证其生物胞里敲降 miRNA 生成过程中的两个关键核酸酶-DroR 检测 IC-N-miR-20 的表达情况。结果表明敲降 Dros 表达明显减少（图 1-5），证明 IC-N-miR-20 的形成途径。

【相似文献】