miR-424-5p负向调控CCNE-1抑制上皮性卵巢癌发生发展及其作用机制的研究

发布时间：2020-08-20 23:37

【摘要】：卵巢癌,女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一,其致死率居高不下。2016年癌症统计数据显示,全美新发病例22,280例,死亡病例14,240例。卵巢癌最常见组织学类型为上皮性癌,约占90%。若早期发现肿瘤局限于卵巢,5年生存率可达70%-90%。然而,由于缺乏特异性标记物及特异性临床症状,卵巢癌难以早期发现,大多数患者确诊时已达晚期,预后极差,总体5年生存率仅有20%-30%。因此,寻找早期检测卵巢癌的新靶点及深入研究卵巢癌的发生发展及转移机制以期寻找新的治疗策略迫在眉睫。MicroRNA(miRNA),是由19-25核苷酸组成的单链。最初在1989年由Vi ctor在秀丽隐杆线虫中发现基因lin-4可以抑制另一个基因lin-14,因此lin-4被认为是一种调控蛋白。在1993年,Rosalind Lee和Phonda Feinbaum成功克隆出lin-4并将其鉴定为一种小的非蛋白质编码RNA。他们发现microRNA lin-4通过特异杂交结合到lin-14信使RNA的非翻译区(3' UTR)形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)诱导目标mRNA的降解或抑制蛋白翻译从而下调lin-14蛋白表达。miRNA高度保守,广泛存在于人类、植物、动物和一些病毒中,很多研究报道已证实miRNA在上皮性卵巢肿瘤中扮演着重要的角色。它们在多种癌症常存在异常表达,并通过改变靶基因转录翻译参与信号通路的微调从而发挥生物学功能。miR-424-5p是内源性microRNA集群中的一员,位于人类染色体Xq26.3。目前已经发现它在许多类型的肿瘤中存在表达异常,如胃癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、宫颈癌、胰脏癌,包括卵巢癌。然而,它在不同组织中扮演着癌基因或抑癌基因两种不同角色。据报道,与胰腺癌组织中的过表达相比,miR-424-5p在肝细胞癌、食管鳞状细胞癌和宫颈癌的水平均呈现不同程度的表达下调。目前对于miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的研究甚少,尽管通过全基因组miRNAs表达谱差异发现miR-424-5p在卵巢癌中表达下调,但也有报道提示miR-424-5p高表达可以促进卵巢癌耐药和肿瘤进展,这可能跟卵巢癌异质性有关或选用了不同来源的卵巢癌细胞引起的相反结论。对于这样的差异引起了我们课题组的兴趣,miR-424-5p在上皮性卵巢癌中到底扮演了怎样的角色呢?是抑癌基因还是癌基因?还是不同条件下的双重角色?目前对于miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的生物学行为及作用机制少有报道。因此,基于上述研究背景,我们有必要探索miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的表达及作用,试图寻找新的靶基因和调控机制,为卵巢癌的基因治疗提供潜在的理论依据。本课题研究内容主要包括以下部分:第一章:miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的表达及临床病理之间的关系;第二章:miR-424-5p靶基因CCNE1的预测及鉴定;第三章:miR-424-及其靶基因对上皮性卵巢癌生物学的影响及调控机制的初步探讨第一章m i R-424-5p及CCNE-1在上皮性卵巢癌中的表达及临床病理特征的关系研究背景及目的:目前,关于上皮性卵巢癌的起源及进展的分子机制尚未完全明确。MicroR NA(miRNAs)在癌症中的研究越来越引起国内外学者的关注,并且已证实其在卵巢肿瘤中也起着重要作用。miR-424-5p在许多癌症中扮演不同角色,而在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及机制,迄今为止鲜有报道。本研究目的是检测miR-424-5p在上皮性卵巢癌组织中及不同卵巢癌细胞系中的表达,分析其与卵巢癌临床病理特征之间的关系及预后价值,探讨miR-424-5p作为上皮性卵巢癌早期诊断的一项新靶标的可能性。研究方法:收集山东大学齐鲁医院经手术和术后病理证实的的上皮性卵巢癌新鲜组织(实验组)83例及正常卵巢上皮组织(对照组)19例,每份标本分成两份,一份行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,另一份行待实验第二部分行免疫组化检测CCNE1的表达。纳入研究的患者术前均未接受任何放化疗。1.采用实时荧光定量PCR检测不同上皮性卵巢癌组织中miR-424-5p mRNA表达水平,并分析miR-424-5p与临床病理参数之间的关系。2.应用Kaplan-Meier绘制生存曲线,并分析miR-424-5p与上皮性卵巢癌预后相关的两个指标总生存率(OS)及无进展生存率(RFS)的相关性。3.采用实时荧光定量PCR检测miR-424-5p在3种不同卵巢癌细胞株HO8910、A2780、SKOV3和永生化正常卵巢上皮细胞株HOSEpiC中的表达差异。研究结果:1.qRt-PCR结果显示,miR-424-5p在上皮性卵巢癌组织中的表达水平(0.3649 ± 0.2709)明显低于正常卵巢上皮组织(1.0000 ± 0.1711),差异显著(**p0.01)。和27例低级别浆液性上皮性卵巢癌相比,miR-424-5p表达含量在44例高级别浆液性上皮性卵巢癌明显下调,二者差异显著(**p0.01)。肿瘤分化程度低,期别越晚,淋巴转移,肿瘤越大,miR-424-5p表达含量越低,差异具有统计学意义(p = 0.0334,0.0036,0.0398,0.0174),与患者年龄、腹水和血清CA125水平无关。2.Kaplan-Meier生存分析结果显示,miR-424-5p高表达与总生存率(OS)(P=0.012)及无进展生存率(RFS)(P=0.020)密切相关。3.qRT-PCR结果显示,与永生化正常卵巢上皮细胞株HOSEpiC相比,miR-424-5p在卵巢癌细胞株Ho8910,SKOV3,A2780表达均下调,差异具有统计学意义(**p0.01)。研究结论及意义:miR-424-5p在上皮性卵巢癌组织及癌细胞系中的表达明显下降,且miR-424-5p与上皮性卵巢癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小密切相关,miR-424-5p高表达患者的总生存率和无进展生存率明显高于miR-424-5p低表达患者,提示miR-424-5p表达缺失在上皮性卵巢癌的发生、发展过程中起重要作用,对判断预后具有重要价值。第二章miR-424-5p靶基因CCNE1的预测及鉴定研究背景及目的:miRNA是一类长度仅有约22nt的单链内源非编码小RNA,通过与互补的mRNA选择性的抑制靶蛋白的产生。研究发现,每个哺乳动物的miRNA可调控约200个靶基因。但到目前为止,对于许多miRNA的功能仍然认识不够,其原因可能是明确的miRNA靶基因数量较少,而靶基因的预测和鉴定的难度又颇大。现阶段,基于计算机算法在内的许多公共数据库可以有助于预测miRNA的种子区结合位点,该种子区为miRNA进化过程中最保守的片段,从第2到第8个核苷酸参与互补mRNA 3'-UTR上的靶位。我们前期研究发现,miR-424-5p在上皮性卵巢癌组织中表达下调,提示miR-424-5p可能作为抑癌基因参与卵巢癌的发生发展。那么miR-424-5p在卵巢癌中是通过哪个靶基因来发挥它的生物学功能的?因此,我们拟通过多种生物信息学算法的共同交集,来提高靶基因预测正确的成功率。根据前述研究中miR-424-5p在不同细胞系中的表达量的不同,选取合适的细胞系对miR-424-5p过表达或者抑制进行相关研究,并通过双荧光素酶报告基因系统进一步提高预测结果的准确性。研究方法:1.应用三种生物信息学(miRDB,TargetscanandmiRanda)运算方法取各自前50名预测分数最高的交集进行初步筛选。2.共转染miR-424-5p模拟物对A2780细胞过表达及miR-424-5p抑制物来降低Ho8910细胞miR-424-5p表达,通过qRT-PCR确定转染效率后,对三个候选靶基因(SLC9A6,AN03和CCNE1)进行验证。3.构建CCNE-1的3'-UTR的荧光素酶表达质粒pGL3-CCNE1,与miR-424-5p的模拟物或抑制剂共转染A2780细胞或Ho8910细胞,观察野生组(WT)和突变组(MU)miR-424-5p对pGL3-CCNE1的荧光素酶活性的影响,进一步判断miR-424-5p是否直接调控CCNE1 3'-UTR区。4.为了研究miR-424-5p对CCNE1表达水平的影响,通过qRT-PCR、Western Blot检测被转染后的A2780和Ho8910中CCNE1的蛋白及mRNA表达水平,来验证二者是否相关性。5.最后,利用免疫组化及qRT-PCR对CCNE1在上皮性卵巢癌中的表达进行检测,进一步确认CCNE1与miR-424-5p之间在卵巢癌中是否相关。研究结果:通过3种不同生物信息学方法(miRDB,TargetscanandmiRanda)选取分数在前50的靶基因进行交集运算,得到SLC9A6,AN03andCCNE1为共同靶基因。1.将miR-424-5p的模拟物和抑制剂的对照组分别转染A2780、Ho8910细胞4小时后在荧光显微镜观察可见带绿色荧光的细胞数占总细胞数达90%以上。qRT-PCR分析结果显示,以miR-NC组miR-424-5p表达量作为1,miR-424-5p 转染组 A2780 细胞中 miR-424-5p 表达量上调 7.559±0.428 倍,差异显著(**P0.01);以inhibitorNC组细胞中miR-424-5p表达量作为1,miR-424-5p inhibitor 转染组 Ho8910 细胞中 miR-424-5p 表达量下调 0.558±0.060倍,差异具有统计学意义(**p0.01)2.qRT-PCR分析结果显示,与NC转染组相比,转染miR-424-5p模拟物的A2780细胞和转染miR-424-5p抑制剂的Ho8910细胞中,SLC9A6,AN03 mRNA水平较对照组相比差异无明显统计学意义。而Western Blot和qRT-PCR分析结果显示,CCNE1 mRNA和蛋白水平在转染miR-424-5p mimics后的A2780细胞中较对照组均有明显下调(1.00±0.077 vs 0.384±0.002)和(1.001±0.019vs0.62±0.019),在转染 miR-424-5p inhibitor 后的Ho8910 细胞中较对照组明显上调(1.001 ±0.057 vs 1.815±0.049)和(1.001±0.063 vs1.422±0.034),组间差异均具有统计学意义(**P0.01)。3.miR-424-5p与靶基因CCNE1作用位点分别位于247-254和485-492处,双荧光素酶报告基因报告验证结果显示,在A2780细胞中miR-424-5p mimics+pGL-CCNE-1 3' UTR-WT共转染组的荧光信号强度明显弱于NC对照组共转染组,差异有显著性(**p0.01)。在Ho8910细胞中miR-424-5p inhibitor+pGL-CCNE-1 3' UTR-WT共转染组的荧光信号强度明显强于inhibitor NC对照组共转染组,差异有显著性(p0.01)。然而,对于突变型载体pGL-CCNE-13' UTR-MU,两组荧光均没有明显区别(*p0.05)。4.免疫组化结果显示,CCNE1在上皮性卵巢癌中及正常卵巢上皮中均有不同程度的表达,CCNE1主要分布于细胞质和细胞核内,呈棕黄色染色,在上皮性卵巢癌中强阳性表达,而在卵巢正常上皮细胞组织中低表达或不表达;qRt-PCR结果同样显示,CCNE1在上皮性卵巢癌组织中的相对表达水平(3.187 ± 0.1519)明显高于正常卵巢上皮组织(1 ± 0.2219),差异显著(**p0.01)。5.免疫组化评分中CCNE1评分越高,miR-424-5p水平越低,二者关系呈显著负相关性(**p0.01)。qRT-PCR结果显示,miR-424-5p低表达患者的CCNE1相对表达量越高,二者关系呈显著负相关性(**p0.01)。研究结论及意义:1.在上皮性卵巢癌中,CCNE1是miR-424-5p的靶基因;2.miR-424-5p可通过调控CCNE1的3'-UTR区抑制CCNE1 mRNA和蛋白表达第三章miR-424-5p及其靶基因CCNE1对上皮性卵巢癌生物学的影响及调控机制的初步探索研究背景及目的:细胞的生长是通过细胞周期来实现的,外部环境及细胞内癌基因激活及抑癌基因的失活都会触发级联式反应开启细胞过度增殖。miRNA可作为癌基因和/或抑癌基因参与细胞周期的调控。在第二章中我们预测并鉴定miR-424-5p在上皮性卵巢癌中的靶基因为CCNE1。CCNE1是细胞周期相关蛋白,在细胞周期中循环式表达,在细胞从G1期向S期转换的过程中起到重要作用,由细胞周期调节蛋白E1基因编码,然后与细胞蛋白依赖性激酶2(CDK2)形成复合物,促进细胞通过细胞周期G1/S期限制点,发挥调控真核细胞有丝分裂的作用。正常情况下,CCNE1在周期中有序进行表达核分裂,异常情况下,表达不稳定可导致细胞周期失控,干扰细胞有丝分裂,导致染色体不稳定,促进肿瘤生长。这一章,我们通过体外实验来观察miR-424-5p对卵巢癌生物学行为的影响,特别是细胞生长、周期及凋亡的影响,并且通过检测下游通路上的相关蛋白来探索其在上皮性卵巢癌中的可能的作用机制。研究方法;1.用Western Blot检测小干扰及过表达CCNE1质粒的效果。2.在 A2780 细胞和 Ho8910 细胞中分别转染 miR-424-5p mimics 和 miR-424-5p inhibitor来过表达或敲低miR-424-5p表达,利用CCK-8实验绘制细胞生长曲线,通过对比各自的转染对照NC组,了解miR-424-5p对细胞增殖的影响。si-CCNE1与miR-424-5p inhibitor共转染或CCNE1过表达质粒与miR-424-5p mimics共转染分别对A2780或Ho8910进行回复实验观察对细胞增殖的影响。3.利用流式细胞技术,观察过表达或敲低miR-424-5p表达后对细胞周期和细胞凋亡的影响,并观察细胞回复实验了解CCNE1对miR-424-5p作用下的细胞周期的影响。4.Western Blot检测CCNE1下游通路的E2F1和pRb蛋白表达水平。研究结果:1.Western Blot结果显示,转染小干扰CCNE1的Ho8910细胞,与si-NC对照组相比,CCNE1蛋白表达水平较对照组明显下降,为0.022±0.0009倍,差异显著(**p0.01);将CCNE1过表达质粒转染到A2780细胞内,与空载组相比,CCNE1蛋白表达水平较对照组明显上升,1.428±0.2034倍,差异具有统计学意义(**p0.01)。2.CCK-8结果显示,与NC转染组相比,转染miR-424-5p mimics的A2780细胞的48-96小时细胞存活率明显下降,分别为0.5731 ±0.041vs 0.396±0.042,1.030±0.054vs0.626±0.052,1.453±0.045vs0.939±0.056;将 CCNE1过表达质粒共转入含有miR-424-5pmimics的A2780细胞,与空载质粒组相比,细胞存活率上升,48小时OD值是0.308±0.025vs0.469±0.042,72小时 OD 值是 0.478±0.026vs0.744 ± 0.055,96 小时 OD 值是 0.739 ±0.046vs1.052±0.069。与 InhibitorNC 转染组相比,转染 miR-424-5p inhibitor的Ho8910细胞的48-96小时细胞存活率明显上升,分别为0.429±0.031vs 0.57±0.032,0.615±0.042vs0.842±0.043,1.020±0.041vs1.545±0.047。将小干扰CCNE1加入转染的miR-424-5p inhibitor的Ho8910细胞系,与si-NC对照组比较(0.687±0.049,0.744±0.055,1.052±0.069.),细胞活力明显下降,细胞生长变慢,48、72、96小时0D值分别是0.637±0.048,0.989±0.070,0.455±0.029,差异均具有统计学意义(*p0.05,**p0.01)。3.流式细胞技术结果显示,与NC转染组(G0/G1期:57.32%±0.286%,S期:34.62%±0.563%)相比,转染 miR-424-5p mimics 的 A2780 细胞的 G0/G1期比例明显升高(72.883%±1.419%),S期明显降低(24.873%±0.86%),差异具有统计学意义(*p0.05,**p0.01);而与转染inhibitor NC相比(G0/G1 期:63.923%±0.309%,S 期:30.162%±0.57%),转染 miR-424-5p inhibitor 的 Ho8910 细胞的 G0/G1 期比例明显下降(55.23%± 1.367%),S期明显上升(38.97%± 1.302%),差异均具有明显统计学意义(*p0.05,**p0.01)。回复实验结果显示共转染CCNE1过表达质粒后可抵抗miR-424-5p对G0/G1期的阻滞作用;干扰CCNE1表达后可以逆转miR-424-5p抑制剂对细胞周期由G0/G1向S期的转化。流式细胞技术结果显示,分别在A2780或Ho8910细胞中上调或下调miR-424-5p的表达,对卵巢癌细胞的凋亡没有显著影响,差异没有统计学意义(P = 0.1173,0.0596)。4.Western Blot检测结果显示,转染miR-424-5p mimics的A2780细胞与对照组相比,E2F1 和 pRb 蛋白明显下降(1.0 ± 0.047 vs 0.416 ± 0.013,1.0± 0.026 vs 0.81 ±0.039),回复实验过表达CCNE1质粒后可以逆转E2F1和pRb蛋白的下调(0.416±0.013vs0.72±0.057,0.81±0.039vs1.147±0.032)。转染miR-424-5p inhibitor的Ho8910细胞与对照组相比E2F1和pRb蛋白明显上升(1.0±0.043vs 1.25±0.041,1.0±0.112vs 1.582±0.069),沉默CCNE1后会削弱对 E2F1 和 pRb 蛋白的上调(1.25±0.041 vs0.419±0.041,1.582±0.069 vs 0.866±0.112)。研究结论及意义:1.miR-424-5p抑制上皮性卵巢癌细胞增殖;2.CCNE1促进上皮性卵巢癌细胞增殖,过表达CCNE1后miR-424-5p抑制细胞增殖的作用被削弱。3.miR-424-5p通过靶向调节CCNE1/E2F1/pRb通路抑制上皮性卵巢癌的细胞增殖。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

扩增曲线

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上皮性卵巢癌,上皮组织,宫内膜样癌,透明细胞癌

逦ｎ＝２７逦ｎ＝ｌ２逡逑图１．４邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ在不同上皮性卵巢癌中的相对表达情况（其中ｏｔｈｅｒ组包括８逡逑例粘液性癌，２例子宫内膜样癌，２例透明细胞癌）。ｍｉＲ－４２４－５ｐ相对表达含量逡逑在高级别浆液性癌较低级别浆液性癌明显下降，二者差异具有统计学意义逡逑（＊＊ｐ＜０＿０１）．逡逑Ｆｉｇｌ．４邋Ｔｈｅ邋ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－４２４－５ｐ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｄｉｆｆｅｒ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ＨＧＳＣ邋ａｎｄ逡逑ＬＧＳＣ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｓｕｂｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ＥＯＣ（＊＊ｐ＜０．０１）逡逑３８逡逑

【参考文献】