性腺外FSHR在小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用及其机制

发布时间：2020-08-27 21:09

【摘要】：目的:初步探究性腺外卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)在小鼠子宫内膜的定位、表达变化及其在妊娠期小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用。方法:1、运用免疫组织化学方法观察分析小鼠妊娠期(D1-D9天)子宫内膜组织中FSHR的表达部位及表达水平的变化。2、使用人工诱导蜕膜化技术构建小鼠人工蜕膜化模型,分析FSHR的表达是否受人工蜕膜化的影响。3、构建去卵巢及用E_2、P_4激素处理的子宫模型,观察经激素处理后FSHR在小鼠子宫内膜表达的变化。4、通过离体实验对小鼠子宫内膜基质细胞进行分离、培养及体外诱导,检测在离体状态蜕膜化过程中FSHR和FSH表达水平的变化。5、运用MTS法,观察不同浓度的重组FSH对小鼠子宫内膜基质细胞增殖的影响。6、运用实时荧光定量PCR技术和蛋白免疫印迹技术观察FSH对小鼠子宫内膜蜕膜化的影响。7、采取RNA干扰技术,观察分析FSHR对小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响。8、运用蛋白免疫印迹技术观察分析FSH对小鼠子宫内膜基质细胞Erk1/2和AKT信号通路的影响。结果:1、通过免疫组织化学方法检测显示,在正常妊娠D1-D4天,FSHR主要定位于子宫内膜的腔上皮和腺上皮细胞。随着蜕膜化的进展(妊娠D5-D9天),植入位点FSHR的表达量均明显增加,且主要表达于围绕胚胎的子宫蜕膜组织,而非植入位点FSHR主要定位于腔上皮和腺上皮细胞。2、在在体人工诱导蜕膜化模型中,假孕第4天时给予一侧子宫角注射芝麻油,与非油侧相比,注射芝麻油一侧的子宫角随妊娠时间的延长(D5-D9天)外形逐渐增大,而非油侧子宫角外形没有明显的变化。在人工诱导蜕膜化的子宫组织中,FSHR表达量随妊娠天数的增加(D5-D9天)而逐渐增加,且主要表达于蜕膜细胞,而非油侧子宫组织中,FSHR没有明显变化,主要表达于腔上皮和腺上皮细胞。3、免疫组织化学方法检测显示,摘除卵巢的子宫组织,经E_2处理12h和24h后,子宫组织中FSHR主要表达腔上皮和腺上皮细胞,而经E_2和其拮抗剂Tam共同处理后,FSHR在子宫组织中几乎无表达;经P_4处理12h和24h的子宫组织中,FSHR表达于腔上皮、腺上皮细胞以及子宫基质细胞,而经P_4与其拮抗剂RU486联合处理后FSHR仅表达于腔上皮和腺上皮细胞。4、细胞免疫荧光染色检测显示,体外分离培养的子宫内膜基质细胞表达波形蛋白(Vimentin)而不表达角形蛋白(Cytokeratin)。在体外经E_2和P_4联合培养24h、48h、72h后,免疫荧光染色结果显示,FSHR蛋白显著表达于子宫内膜基质细胞的胞浆和胞膜;蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示,蜕膜化标记分子Cyclin D3蛋白和prl8a2 mRNA的表达水平在体外培养48h、72h后,与24h相比较,均显著性增加(P0.05或0.01)。同时,Fshb mRNA和Fshr mRNA的表达水平,也随时间的延长而逐渐增加(P0.01)。5、通过MTS实验观察分析,培养96h后,与Control组相比,3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml的FSH均明显促进基质细胞的增殖(P0.05或0.01),而300ng/ml、600ng/ml、1000ng/ml的FSH,与Control组相比,均明显抑制了基质细胞的增殖(P0.05或0.01)。10ng/ml的FSH在体外培养24h、48h、72h、96h后,与0h相比,均能明显促进基质细胞增殖(P0.05或0.01)。6、运用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测显示,经FSH、E_2+P_4、E_2+P_4+FSH处理子宫基质细胞48h和72h后,蜕膜化标记分子Cyclin D3蛋白的表达水平,与Control组相比均明显增加(P0.05或0.01)。同时,与E_2+P_4组相比,E_2+P_4+FSH组中蜕膜化标记分子prl8a2 mRNA的表达量显著增高(P0.01)。7、与Blank Control组相比,转染FSHR siRNA+FSH组的Fshr mRNA和FSHR蛋白表达水平均明显下降(P0.05或0.01),而转染Scramble siRNA组无明显变化。FSHR基因受干扰的同时,蜕膜化的标记分子prl8a2 mRNA和Cyclin D3蛋白的表达水平也均相应下降(P0.05或0.01),提示FSHR基因的下调能明显抑制子宫内膜基质细胞蜕膜化的进程。8、蛋白免疫印迹结果显示,与0min相比,随着时间延长,10ng/ml FSH处理子宫内膜基质细胞,能明显增加AKT和Erk1/2磷酸化水平,至60min时,AKT和Erk1/2磷酸化水平均达到最大。结论:在妊娠早期,FSHR时空性的表达于妊娠小鼠子宫内膜母胎界面,且其表达部位和表达量变化受E_2、P_4及子宫内膜蜕膜化的影响;小剂量FSH可促进子宫内膜基质细胞的增殖和蜕膜化;FSHR干扰后,子宫内膜基质细胞的蜕膜化受到显著的抑制,说明FSHR具有促进子宫内膜蜕膜化的作用。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714
【图文】：

阳性对照,放大倍数,腺上皮,上皮

图 1.FSHR 在小鼠妊娠 D1-D4 天子宫内膜的定位与表达Figure 1. Localization and expression of FSHR in the mice uteri during pregnancy D1-D4A.阳性对照为附睾组织，B.阴性对照为妊娠第 3 天子宫组织；C-F 分别为妊娠第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 4 天子宫组织，A1-F1 放大倍数（×100）；A2-F2 分别为 A1-F1 图中方框部位的放大图（×400）。GE：腺上皮;LE：腔上皮;S：基质。

位点,免疫组化染色

图 2 FSHR 在小鼠妊娠 D5-D9 天植入位点和非植入位点的定位与表达Figure 2. Localization and expression of FSHR in mice implanted and non-implanted sites during D5-D9 days of pregnancyA-E 分别为妊娠第 5 天、第 6 天、第 7 天、第 8 天、第 9 天子宫组织 FSHR 免疫组化染色图；

外形图,假孕,蜕膜化,人工诱导

图 3 FSHR 在人工诱导蜕膜化小鼠子宫内膜中的表达与定位Figure 3. Expression and localization of FSHR in artificially induced decidualized mouseendometriumA-E 为假孕第 5 天、第 6 天、第 7 天、第 8 天、第 9 天子宫组织；A1-E1 分别为假孕 D5-D9 的子宫外形图；

【参考文献】