FSHR基因与中国早发性卵巢功能不全及宫颈癌发病风险的相关性研究

发布时间：2020-08-31 17:10

　　 第一章中国汉族早发性卵巢功能不全患者FSHR基因突变筛查及功能研究背景:早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI),既往称为卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF),是一种临床特征和发病原因均呈高度异质性的常见妇科内分泌疾病。其临床表现主要为原发性闭经或女性40岁以前出现继发性闭经,同时伴有促性腺激素升高与雌激素水平降低等引起的围绝经期症状。POI病因复杂,包括遗传学因素、免疫学因素、代谢性因素、医源性因素与环境因素等。40岁以前女性POI发病率约为1%,但近年来呈现上升趋势。由于POI发病隐匿且呈不可逆性,目前尚无可靠的早期诊断指标,也无有效的干预或治疗方法。因此,针对POI的病因学与早期识别高风险人群的研究意义重大。目前研究已证实遗传学缺陷是POI发病的重要原因,占POI发病因素的20%～25%。近年来,基于基因组学技术的发展,通过候选基因筛查与全外显子组测序等方法,目前已明确十余个POI致病基因。卵泡刺激素(Follicle-stimμlating hormone,FSH)是一种重要的生殖激素,通过与分布于性腺的卵泡刺激素受体(FSH receptor,FSHR)结合,激活下游的cAMP-PKA信号通路,引起靶蛋白发生磷酸化,从而参与并维持正常的性腺发育和生殖功能。FSHR基因是发现的第一个非综合征型POI的致病基因。迄今为止,FSHR基因突变仅在芬兰POI人群中有报道,而在其他种族人群中较为罕见,因此FSHR基因突变的致病性具有较强的种族特异性。目前尚无大样本中国POI人群与FSHR基因相关性的报道。第一节中国汉族早发性卵巢功能不全家系FSHR基因突变筛查及功能研究目的:对一个中国汉族POI家系先证者及家系成员进行FSHR基因的突变检测,并对潜在新发突变进行体外功能实验,探讨FSHR基因突变的致病机制。方法:先证者30岁,原发性闭经,染色体核型正常。先证者行腹腔镜下卵巢组织活检术,活检卵巢组织行HE染色。收集该POI家系成员与192例正常对照女性的外周血,抽提基因组DNA;采用Sanger法对先证者及其家人的FSHR基因的外显子及其侧翼序列进行测序,并在192例对照女性中对可疑突变进行验证。体外构建野生型和突变型质粒,转染人胚胎肾细胞系HEK293T细胞。转染后48h,分别采用Western blot和细胞免疫荧光法检测目的蛋白的表达情况,采用cAMP试剂盒检测FSH刺激后的cAMP生成情况。结果:Sanger法测序发现先证者携带1个新发纯合无义突变c.175CT(p.R59X),其父母为杂合携带者,符合常染色体隐性遗传。该突变导致FSHR蛋白由695个氨基酸截短为59个氨基酸,从而导致丧失重要功能域。保守性分析结果显示,该突变所在位点氨基酸在各物种间保守性较高。Western blot和细胞免疫荧光结果显示,R59X突变组未检测到FSHR表达,提示R59X突变导致全长FSHR蛋白不能表达。cAMP实验结果显示,给予FSH刺激后,野生组cAMP水平逐渐升高,并在刺激后20 min左右达到峰值,R59X突变组cAMP水平无变化。此外,HE染色发现先证者卵巢活检组织内可见较多原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及两个直径分别为0.25 mm和0.625 mm的早期窦卵泡。结论:本研究在POI家系中发现了 1个FSHR基因新发突变c.175CT(p.R59X),该突变导致FSHR蛋白功能丧失,从而阻断卵泡发育,参与POI的发生。第二节中国汉族散发性早发性卵巢功能不全患者FSHR基因突变筛查及功能研究目的:探究中国汉族散发性POI患者FSHR基因突变情况,并对潜在新发突变进行功能研究。方法:收集192例中国汉族散发性POI患者与192例对照女性,抽提外周血基因组DNA;采用Sanger法对FSHR基因的外显子及其侧翼序列进行测序并对可疑突变进行验证。体外构建野生型和突变型质粒,转染人胚胎肾细胞系HEK293T。转染后48h,分别采用细胞免疫荧光法和流式免疫定量检测目的蛋白的表达情况,采用cAMP试剂盒检测FSH刺激后的cAMP生成情况,采用Western blot检测FSH刺激后的ERK磷酸化水平。结果:对192例中国汉族散发性POI患者行FSHR基因测序,发现3个新发杂合突变:包括2个错义突变c.793AG(p.M265V)和c.1789CA(p.L5971),以及1个同义突变c.1821CT。保守性分析结果显示,597位点氨基酸在各物种间保守性较好。此外,在POI患者中筛查出6个已知SNP位点:rs1394205(5'UTR),rs115030945(外显子 1),rs75552966(外显子 8),rs6165(外显子 10),rs6166(外显子10)和rs140106399(3'UTR)。统计分析结果显示,rs1394205和rs140106399的基因型和等位基因在病例组与对照组中的分布有统计学差异。细胞免疫荧光染色结果显示,野生组与M265V、L597I两突变组均有FSHR的膜定位表达。流式免疫定量结果显示,L597I突变组中FSHR的细胞膜定位较野生组显著减少。cAMP实验结果显示,给予FSH刺激后,L597I突变组各时间点cAMP水平均低于野生型,M265V突变组各时间点cAMP水平与野生型无显著性差异。Western blot结果显示,给予FSH刺激后,野生组和两突变组ERK1/2磷酸化均在5 min时达到峰值;L5971突变组各时间点ERK1/2磷酸化水平均低于野生组,M265V突变组各时间点ERK1/2磷酸化水平与野生型无显著性差异。此外,L597I突变不具有显性负效应。结论:本研究在中国汉族散发性POI人群中发现了FSHR基因新发突变,FSHR基因在POI患者的突变频率为1.6%(3/192),突变L597I影响了 FSHR蛋白的功能,参与POI的发生。第二章FSHR基因变异与中国汉族宫颈癌发病风险的相关性研究背景:宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤,其发病率及死亡率仅次于乳腺癌。由于个体在遗传水平上对宫颈癌的易感性有差异,因此我们通过基因的遗传变异与疾病易感性或抵抗性的研究,可以获悉宫颈癌的易感性或保护性基因型,从而获得用于筛选宫颈癌易感或高危人群的分子标签。目前有关基因多态性与宫颈癌的研究主要包括炎症免疫相关基因、细胞因子相关基因、代谢酶基因和DNA损伤修复基因等4类。卵泡刺激素FSH是最重要的女性激素之一,通过与其特异性的受体FSHR结合,在调控卵泡发育和雌激素合成等过程中发挥不可缺少的作用。目前已有较多关于FSH、FSHR与卵巢癌、乳腺癌等肿瘤发生发展的研究报道。此外,本课题前期研究在1例宫颈癌患者中发现FSHR基因R59X杂合突变,该突变曾在子宫内膜癌和乳腺癌患者中报道。最新研究显示FSHR基因内含子区的已知SNP(rs1007541)与突尼斯宫颈癌发病风险相关。这些均提示FSHR基因可能是宫颈癌的候选基因。目的:初步探讨中国汉族宫颈癌患者FSHR基因突变及多态性与宫颈癌发病的相关性。方法:收集2015年10月～2018年3月就诊于山东省肿瘤医院的130例宫颈癌患者与2018年1月～2018年3月就诊于山东大学齐鲁医院健康查体中心的200例健康女性的外周血,抽提基因组DNA;采用Sanger法对FSHR基因的编码区及其侧翼序列进行测序。采用HaploView 4.2软件对各SNP进行哈代温伯格平衡检测。采用卡方检验比较各SNP在宫颈癌与对照组中的基因型和等位基因分布情况。采用Logistics逻辑回归分析计算不同基因型和等位基因反映的疾病风险性。结果:对130例中国汉族宫颈癌患者行FSHR基因测序,发现1个新发杂合错义突变c.785AG(p.V262A)(3/130),该位点氨基酸具有较好的保守性。此外,在宫颈癌患者中筛查出7个已知SNP位点:rs1394205(5'UTR),rs115030945(外显子 1),rs749571389(外显子 3),rs757713421(外显子 10),rs6165(外显子10),rs6166(外显子10)和rs140106399(3'UTR)。统计分析结果显示,rs1394205(c.-29GA)和rs140106399(c.*111TC)的基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布有统计学差异。Logistics回归分析结果显示,其中rs1394205位点与宫颈癌发病呈正相关,AA基因型增加宫颈癌的患病风险,A等位基因为宫颈癌的危险因素;rs140106399位点与宫颈癌发病呈负相关,CC基因型降低宫颈癌的患病风险,C等位基因为宫颈癌的保护性因素;但是由于研究样本量相对较少且后者的较小等位基因频率(MAF)偏低,所以其与宫颈癌的相关性有待进一步证实。结论:本研究首次在中国宫颈癌患者中发现了 1个FSHR基因新发突变c.785AG(p.V262A)(3/130),其功能影响有待进一步研究;此外发现FSHR基因多态性与宫颈癌发病存在一定的相关性。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R711.75;R737.33
【部分图文】：

图１．先证者卵巢活检组织的Ｈ＆Ｅ染色。（Ａ）显示了卵巢皮质内较多的原始卵泡（ＰｒＦ）与逡逑初级卵泡（ＰＦ）邋（ｘ４００）；邋（Ｂ）显示了由２？３层颗粒细胞围绕中央的卵母细胞形成的次级卵逡逑泡（ＳＦ）邋（ＭＯＯ）；邋（Ｃ）显示了两个直径约为０．６２５邋ｍｍ和０．２５邋ｍｍ的窦早期卵泡０４０）。逡逑图２．邋ＰＯＩ家系图及Ｒ５９Ｘ突变的相关信息逡逑Ａ邋ｉ逦ｐｆｊ逦＾逦Ｂ邋Ｔ邋ＴＣ７ＴＧ邋Ａ邋Ｔ邋ＴＣ７ＴＧ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｇ邋Ａ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｇ邋Ａ逡逑ｎ逦４逦６邋八／ｖｗ＼邋ＡＡｍＡ邋／Ｗ／Ｖ＼邋Ａ／＇／ｗ＼逡逑２逦ｉ－ｉ逦ｉ－２逦ｎ－ｉ逦ｎ－２逡逑Ｃ邋Ｈｏｍｏ邋ＡｍＪＲＦＶＬＴＭ＾ＩＱＫＧＡｒｅＧｒｃ邋Ｄ逦＾邋＾邋＾邋＾邋＾逡逑Ｌａｒａｈｃ0逦，逡逑Ｓｕｓ逦ＡＶＨＬＲＦＶＬＴＫＬ邋Ｒ邋ＯＴＪＣＧＡＦＳＧＲ；逦＾邋＾邋＾逡逑Ｏｖｉｓ邋ＡＶＥＬＫＦＶＬＴＫＬＲｍＫＡＦＳＧＲ；逦ＩｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍＬｌＬＬＬ邋Ｘ邋Ｌｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ逡逑Ｍｕｓ逦ＡＩＨＪＲＦＶＬ１ＫＬ邋Ｒ邋ＯＴＫＧＳＦＳＯ＾逦Ｔｘｎ）逡逑Ｒａｔｔｕｓ邋ＡＩＥＬＫＦＶＬＴＫＬＲｎ？；＾ＡＣ３Ｒ＆逦，逦■邋Ｉ逡逑？；？？？？？？：＊：？：？￡？［逦＊逦ＴＬＸ邋ＴＪ邋ＸＪ邋Ｉ邋／—＞．ｗ逡逑ｐ．ｒＬ逦ｉｃｄ１逦ｕｉ＿ｃｏｏｈ逡逑

六．附录与附图逡逑图１．先证者卵巢活检组织的Ｈ＆Ｅ染色逡逑图１．先证者卵巢活检组织的Ｈ＆Ｅ染色。（Ａ）显示了卵巢皮质内较多的原始卵泡（ＰｒＦ）与逡逑初级卵泡（ＰＦ）邋（ｘ４００）；邋（Ｂ）显示了由２？３层颗粒细胞围绕中央的卵母细胞形成的次级卵逡逑泡（ＳＦ）邋（ＭＯＯ）；邋（Ｃ）显示了两个直径约为０．６２５邋ｍｍ和０．２５邋ｍｍ的窦早期卵泡０４０）。逡逑图２．邋ＰＯＩ家系图及Ｒ５９Ｘ突变的相关信息逡逑

图３．邋ＰＯＩ家系成员的基因型分析。（Ａ）显示Ｔａｑ邋Ｉ核酸内切酶消化前的４９３邋ｂｐ全长目的片逡逑段；（Ｂ）显示ＴａｑＩ核酸内切酶消化后的ＰＣＲ产物，右侧箭头自上而下分别表示４９３邋ｂｐ全逡逑长片段以及Ｔａｑ邋Ｉ核酸内切酶消化产生的３１８邋ｂｐ和１７５邋ｂｐ目的片段。逡逑图４．Ｗｅｓｔｃｒｎ邋ｂｌｏｔ法检测转染后４８ｈ２９３Ｔ细胞中ＦＳＨＲ蛋白的表达情况逡逑ｃ0＾Ｓ邋＾邋＾逡逑１８０ｋＤ邋ｍ逡逑１４０ｋＤ邋Ｖ逡逑１００ｋＤ邋§逡逑＜—ＦＳＨＲ邋（－８７ｋＤ）逡逑７５ｋＤ邋ｆ．逦．逡逑６０ｋＤ邋？逦？逡逑４５ｋＤ邋｜逡逑３５ｋＤ邋■＞逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 石玉荣;耿建;程龙强;王慧;章尧;;细胞色素P450 1A1基因多态性与宫颈癌的相关性[J];复旦学报(医学版);2011年05期

本文编号：2809094