卵丘颗粒细胞通过增加巴豆酰化修饰促进卵母细胞体外成熟的作用

发布时间：2020-09-02 19:33

　　 【目的】探究卵母细胞体外成熟不同时期对应的卵丘颗粒细胞总体巴豆酰化修饰及催化酶的差异,进而探究巴豆酰化修饰对卵母细胞体外成熟的影响,为完善卵母细胞体外培养体系提供研究基础。【方法】1、通过GEO数据库挖掘及统计分析,比较人卵母细胞体内成熟不同时期对应的卵丘颗粒细胞巴豆酰化修饰催化酶(EP300、CBP、SIRT1、SIRT2、SIRT3、HDAC3、CDYL)的差异;2、通过收集临床样本,采用点杂交检测卵母细胞体外成熟不同时期对应的卵丘颗粒细胞总体巴豆酰化修饰差异;通过Q-PCR检测不同时期卵丘颗粒细胞巴豆酰化修饰催化酶(EP300、CBP、SIRT1、SIRT2、SIRT3、HDAC3、CDYL)的差异;以及与卵丘扩展的相关性;3、通过对原代培养的卵丘颗粒细胞进行巴豆酸钠处理,利用点杂交、PCR、WB检测巴豆酸钠对卵丘颗粒细胞巴豆酰化修饰水平及巴豆酰基转移酶EP300、CBP的影响;通过CCK8检测巴豆酰化修饰对卵丘颗粒细胞和293T细胞系增殖率的影响;通过WB检测巴豆酰化修饰对卵丘颗粒细胞和293T细胞系凋亡的影响;通过PCR检测卵丘扩展基因(HAS2、PGR、PTGS2、PTX3、TNFAIP6)的表达。4、通过小鼠IVM模型,比较巴豆酰化实验组与对照组卵母细胞体外培养成熟率。【结果】1、GEO数据库挖掘的统计分析结果显示MII期巴豆酰化修饰水合酶(CDYL)表达量明显低于GV期,表明卵母细胞体内成熟不同时期对应的卵丘颗粒细胞巴豆酰化修饰酶的表达存在差异;2、收集人IVM过程中卵母细胞成熟不同时期对应的卵丘颗粒细胞,点杂交结果显示成熟的卵丘颗粒细胞的总体巴豆酰化水平逐渐增加,Q-PCR技术检测巴豆酰基转移酶EP300在成熟卵丘颗粒细胞中显著上调;且EP300的表达量与卵丘扩展程度及巴豆酰化修饰水平存在正相关性;3、通过对原代培养的卵丘颗粒细胞进行巴豆酸钠处理,点杂交、PCR检测结果显示巴豆酸钠可促进卵丘颗粒细胞总体巴豆酰化修饰水平增加及EP300表达上调;WB检测结果显示巴豆酰化修饰可促进卵丘颗粒细胞增殖抑制其凋亡,对293T细胞的作用相类似;且可上调卵丘扩展基因的表达,加速卵丘颗粒细胞的扩展,恢复卵母细胞减数分裂进程;4、通过小鼠IVM模型,统计分析结果显示巴豆酰化实验组较对照组卵母细胞体外成熟率明显增高,表明增加巴豆酰化修饰可促进卵母细胞体外成熟。【结论】在卵母细胞体外成熟过程中,卵母细胞不同时期对应的卵丘颗粒细胞通过上调巴豆酰基转移酶EP300增强巴豆酰化修饰水平,加速卵丘扩展,促进卵母细细胞体外成熟。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R714.8
【部分图文】：

（CBP/EP300）、去巴豆酰化酶（SIRT1、SIRT2、SIRT3、水合酶 CDYL。卵丘颗粒细胞的数据统计分析结果提示卵母巴豆酰化修饰催化酶存在差异：GV 期未成熟卵丘颗粒细胞胞之间，其调控蛋白质赖氨酸巴豆酰化修饰（Kcr）目的基差异。MII 期巴豆酰化修饰水合酶（CDYL）表达量明显低＜0.001），提示成熟卵丘颗粒细胞的巴豆酰化修饰水平较胞的巴豆酰化修饰水平较低，说明卵丘颗粒细胞在体内成熟异性的巴豆酰化修饰。通过对 GSE31681 数据库数据再挖掘分析，其统计结果细胞可能发生了巴豆酰化修饰，且不同时期的卵丘颗粒细胞化修饰水平。

期卵丘颗粒细胞进行临床验证，以评价体外成熟过程中巴过点杂交技术检测不同时期卵丘颗粒细胞总体巴豆酰化修着卵母细胞的成熟，卵丘颗粒细胞的总体巴豆酰化水平逐0.05），表明不同时期卵丘颗粒细胞总体存在巴豆酰化修豆酰化修饰相关催化酶均来源于乙酰化修饰酶体系，同时作用，我们同时验证了不同时期卵丘颗粒细胞是否存在乙结果显示 GV 期、MI 期、MII 期卵丘颗粒细胞乙酰化修饰图 1-2 B，p＞0.05），表明卵母细胞体外成熟与乙酰化实验结果表明 IVM 过程中不同时期的卵丘颗粒细胞的总体差异；结合 GEO 数据库结果，表明在体内成熟过程与体外胞巴豆酰化修饰水平存在不同调控模式。

图 1-3：IVM 过程中卵丘颗粒细胞的巴豆酰化修饰水平、扩展程度与 EP300 mRNA 水相关性。（A）巴豆酰化修饰调控酶 EP300 mRNA 转录水平的表达，（B）其他调控表达水平；mRNA 转录水平通过 Taqman 探针 RT-PCR 方法检测，ACTB 作为内参参（C）卵丘扩展程度与 EP300 表达量的相关性，把 1~4 级扩展程度的卵丘颗粒细胞分组：1~2 级归为紧密扩展程度组（low cumulus expansion），3~4 级归为松散扩展程（high cumulus expansion），分别检测两组 EP300 的表达量并统计分析；分别根据颗粒细胞 Kcr 和 Kac 点杂交强度分为三组，+：弱修饰作用，++：中度修饰作用，+++：饰作用，分别检测（D）巴豆酰化修饰水平、（E）乙酰化修饰水平与 EP300 表达量的性并统计分析； *：p<0.05， **：p<0.01，有统计学差异。2.2.4 验证 siEP300 对卵丘颗粒细胞巴豆酰化的影响

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本文编号：2811012