Shh信号通路在子宫内膜的表达及在宫腔粘连中的作用研究

发布时间：2020-09-15 15:02

　　背景:1894 年 Fritsh 提出了宫腔粘连(Intrauterine Adheions,IUA)的概念,1948 年又由Asherman进一步定义,临床表现为月经量明显减少、痛经、闭经,继发不孕、习惯性流产等,对育龄期妇女身体心理造成显著伤害,近年来受到越来越多的关注。目前,临床大多应用以宫腔镜下宫腔粘连分离术(transcervicalresectionof adhesion,TCRA)为主,术后给予多种辅助联合治疗。然而,由于各种方法都存在利弊,预后随访效果也无明显差距,临床治疗法尚未统一。尽管术后人工周期药物治疗对子宫内膜有一定的修复作用,在宫腔置放宫内节育器与透明质酸钠可有效降低再粘连的发生,重度宫腔粘连术后复发率仍高达20.0%～62.5%。因此现阶段的研究热点即:寻找宫腔粘连术后有效地促进子宫内膜再生以恢复宫腔形态和功能的治疗方法。内膜组织损伤被广泛的认为是IUA发生的特异性危险因素,子宫内膜组织损伤后产生的纤维变性组织对于粘连的形成有潜在作用。已发现多条信号通路及其相关蛋白共同参与宫腔粘连的发生发展。Hedgehog(Hh)信号通路作为当下细胞内信号通路的热点,其中Shh配体的作用原理和功能在目前的研究中较为清楚。Shh信号通路在各阶段生理过程中皆发挥作用,在胚胎发育的早期参与细胞的形成、增殖和分化,在胚胎发育的后期参与促进干细胞的形成和分化等。Shh信号通路的异常激活与许多疾病的发生发展有着直接或间接的关系。已有研究提示Shh通路的异常激活在宫腔粘连的发生发展过程中可能发挥作用。由此,本研究以Shh信号通路为切入点,探讨Shh信号通路及相关因子在正常子宫内膜组织中的表达及在宫腔粘连发生发展中发挥的作用,接着研究Shh信号通路对子宫内膜间质细胞增值以及对纤维化转变的影响,为宫腔粘连术后药物治疗提供理论依据。方法:本研究选取2017年3月至2017年6月在浙江大学附属邵逸夫医院行宫腔镜宫腔粘连分离术在术中及术后诊断为中重度宫腔粘连患者20例作为研究对象,宫腔镜宫腔粘连分离术中以刮匙刮取粘连组织周围的子宫内膜及疤痕组织,同时取同期因其他原因行宫腔镜探查非粘连患者的正常的子宫内膜组织20例,术后病理结果分别为10例增生期,10例分泌期作为对照组。首先通过检测Shh蛋白及其信号通路相关蛋白Ptch,Smo、Gli2、Gli3蛋白在增生期、分泌期子宫内膜中定位及表达,接着比较宫腔粘连患者子宫内膜与正常增生期子宫内膜中相关指标(Collagen I,E-cadherin,Ki67)和Gli2定位和表达。通过子宫内膜间质细胞转染Gli2过表达质粒,利用划痕实验观察Shh信号通路抑制剂Cycloamine(Smo-dependent)和rShh的作用,并且探讨Shh信号通路对子宫内膜间质细胞增殖以及对纤维化的影响。结果:本研究结果显示在增生期内膜中,Shh蛋白中等强度的表达,主要表达在间质和腺上皮中。膜受体Smo在子宫内膜中低度表达,膜受体Ptch则呈现散状分布,主要表达在腺上皮和腔上皮,在间质也有表达。Gli2、Gli3主要表达在上皮和腺体。在分泌期内膜中,Shh蛋白中等强度的表达,主要表达在间质中。Ptch、Smo低表达,特异性的表达主要在腺上皮,间质也有表达。Gli2,Gli3强表达,表达在间质和腺体。宫腔粘连患者的子宫内膜组织(疤痕组织)中腺上皮细胞及胞质均可见Collagen Ⅰ,Ki67蛋白阳性表达。在病灶部位的腺上皮中,E-cadherin的表达显著升高。另外,转染过表达Gli2后的子宫内膜间质细胞,Gli2的表达亦升高,纤维化指标CollagenI表达水平明显上调。在划痕试验中,rShh可以促进子宫内膜间质细胞的修复,而cyclopamine则抑制子宫内膜间质细胞的修复。结论:Shh信号通路在正常子宫内膜的增生期和分泌期都发挥作用,且相对在分泌期内膜中表达水平更高。Gli2,CollagenI,Ki67,蛋白在宫腔粘连患者宫腔组织中表达均较正常子宫内膜表达增加,E-cadherin在粘连部位中腺上皮的表达上升,这就说明宫腔粘连是纤维化的过程,伴随腺上皮上皮结构和细胞的异常增生。在体外细胞实验中,Shh信号通路能促进子宫内膜间质细胞的修复,促进纤维化指标的升高。这些结果都表明Shh信号通路在促进宫腔粘连的发生、发展发挥重要作用。抑制Shh信号通路可能对于延缓宫腔粘连的进程有治疗性意义。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R711.74
【部分图文】：

子宫内,增生期,蛋白,患者

邋Ｍａｓｓｏｎ染色，免疫组织化学分析Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ，Ｇｌｉ２蛋白在增生期子宫内逡逑膜、宫腔粘连患者宫腔组织中定位及表徸；Ｂ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析增生期子宫内逡逑膜、宫腔粘连患者宫腔组织ＧＵ２蛋白表徸水平的比较（Ｐ＜０．０５＝）；邋Ｃ，Ｍａｓｏｏｎ和逡逑ＣｏｌｌａｇｅｎＩ，Ｇｌｉ２蛋白免疫组化的ＨＳＣＯＲＥ评分逡逑Ｆｉｇ４．邋Ａ，Ｍａｓｓｏｎ邋，邋Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣｏｌｌａｇｅｎＩ邋，邋Ｇｌｉ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ逡逑ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｐｈａｓｅ邋ａｎｄ邋ＩＵＡ邋ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ逡逑Ｂ邋，邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋Ｇｌｉ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ邋ｐｈａｓｅ邋ａｎｄ邋ＩＵＡ逡逑ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ邋ｂｙ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ．邋（Ｐ＜０．０５邋＝邋）；邋Ｃ，邋Ｍａｓｓｏｎ邋ａｎｄ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ逡逑ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ＨＳＣＯＲＥ逡逑

增生期,子宫内膜,蛋白,患者

逦２．４宫腔粘连患者子宫内膜（疤痕组织）与对照}D正常的增生期子宫逡逑内膜中Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｋｉ６７蛋白的表徸和定位逡逑接着实验检测了邋Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，邋Ｋｉ６７在宫腔粘连患者宫腔组织中的表徶和位。选取宫腔粘连组织进行石蜡包埋和切片，利用免疫组化方法检测Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｋｉ６７蛋白在宫腔粘连患者宫腔组织中的表徶和定位。逡逑研究结果显示，与对照组正常增生期内膜相比，患者的子宫内膜组织（疤组织）中，子宫内膜腺上皮细胞胞核可见Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白中等强度表达，表达显增强；Ｋｉ６７主要散布在间质中，腺上皮中亦存在。Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ在枯连部位中腺逡逑上皮的表达上升。这就说明宫腔粘连的发生有腺上皮上皮结构和细胞的异常生。（Ｆｉｇ５．Ａ）随后，我们对免疫组化的染色强度和面积进行Ｈ－ＳＣＯＲＥ评分，逡逑差异明显，有统计学意义（Ｆｉｇ５．Ｂ）。逡逑Ａ逦Ｒ逦Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑

子宫内膜间质细胞,波形蛋白

数为具有成纤维细胞形态的梭形细胞，胞质丰富，核椭圆，至少可稳定传代７—８次；逡逑用波形蛋白单克隆抗体进行免疫化学染色，在显微镜下观察，后行免疫组化检测，逡逑结果表明，原代培养的ＨＥＳＣ波形蛋白，阳性细胞占９５％以上（见图６）。逡逑Ａ逡逑ｂ逡逑、，邋？逡逑Ｂ邋‘…、／（，，：逡逑ｌ邋＇ｒ．邋、．，逦＊邋？逡逑＼邋？邋＼邋：邋＂逡逑ｋ邋？逡逑ｍ逡逑图６：子宫内膜间质细胞的分离、培养和鉴定。Ａ，原代分离培养的间质细胞；逡逑Ｂ，为子宫内膜间质细胞呈波形蛋白阳性逡逑Ｆｉｇ６．邋Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，邋Ｃｕｌｔｕｒｅ，邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ邋ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２１逡逑

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