超低温冷冻微量睾丸精子在辅助生殖助孕周期中的应用研究

发布时间：2020-10-10 02:25

　　研究目的:本研究评估对无精子症患者行睾丸穿刺取精术(TESA)获取的微量精子在超低温冷冻后的复苏效率,并比较冻融后的TESA来源精子与新鲜TESA精子在行卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗后的临床结局。研究方法:超低温冷冻技术在人类辅助生殖中应用十分广泛,包括卵细胞,精子,胚胎冷冻等。正常男性精子冷冻技术十分成熟,广泛应用于各大人类精子库。但是无精子症患者行TESA后获得的精子由于精子密度低,活率差,采用常规精子冷冻方法效果不理想。本研究摸索了微量精子冷冻技术,结合ICSI应用于严重男性因素不孕症患者,进行临床治疗。回顾性分析2015年1月至2016年12月在山东大学附属生殖医院接受ICSI治疗的273例无精子症患者共273个治疗周期的临床资料,根据行ICSI治疗精子来源不同,分为冷冻TESA精子组和新鲜TESA精子组。将无精子症患者行睾丸穿刺活检所获的TESA精子提前冷冻,在取卵日将冷冻精子解冻后找到可用精子行ICSI,这部分治疗周期归为冷冻TESA精子组,共79个周期。将新鲜TESA来源精子行ICSI治疗的周期归为新鲜TESA精子组,共194个周期。比较两组的双原核(2PN)受精率、优质胚胎率、囊胚形成率、种植率、临床妊娠率、流产率、活产率有无统计学差异。研究结果:1.冷冻TESA精子组与新鲜TESA精子组间男女方平均年龄、女方平均身体质量指数、平均不孕年限、基础促卵泡激素(FSH)水平、hCG日雌二醇(E2)水平、Gn使用总剂量、卵巢刺激持续时间、hCG日子宫内膜厚度等基础临床资料数据相比,差异均无统计学意义(p0.05)。2.冷冻TESA精子组的正常双原核受精率、优质胚胎率、优质囊胚率(73.4%、54.5%、60.1%)与新鲜TESA精子组(71.4%、55.3%、60.9%)相比,差异无统计学意义(p0.05)。3.比较两组中质量差的胚胎发育形成囊胚的囊胚形成率和优质囊胚率。冷冻TESA精子组囊胚形成率、优质囊胚率(56.7%、29.0%)与新鲜TESA精子组(50.4%、27.2%)相比,冷冻组的囊胚形成率和优质囊胚率均高于新鲜精子组,但是差异均无统计学意义(p0.05)。4.冷冻TESA精子组总胚胎种植率、临床妊娠率、自然流产率、出生率分别为42.7%、55.1%、14.8%、45.7%,新鲜TESA精子组总胚胎种植率、临床妊娠率、自然流产率、出生率分别为47.3%、61.7%、13.6%、51.1%,两组间差异均无统计学意义(p0.05)。结论:微量TESA精子冷冻复苏后行ICSI治疗可以获得较好的临床妊娠结局,可以避免反复穿刺取精对睾丸带来的损伤,减少患者经济和精神上的负担,对无精子症患者来说是一种安全有效的治疗方法。但是关于微量TESA精子冷冻复苏后行ICSI治疗对新生儿个体发育的影响,还需要更多的基础研究和临床结果追踪加以探讨及验证。意义:微量精子冷冻,能够减少反复手术对男性患者身体的伤害,极大程度保存了患者生育力,具有极高的临床应用价值。目前国内生殖中心正式开展这项技术的并不多,本研究为微量精子冷冻在临床上的应用,提供了较为丰富的临床资料和经验,为微量精子冷冻的技术发展提供了很好的思路。本研究首次采用麦管为冷冻载体,结合冷冻保护剂冷冻微量睾丸精子。这种冷冻方法的精子回收率与正常精子冷冻相比无显著性差异。经过前期大量预实验,精子回收率较高,并且操作简便,适合实验室实际工作需要。同时研究中使用复苏后的精子行ICSI治疗取得了较为理想的临床结局,各项数据都无显著性差异。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R714.8
【部分图文】：

过程图,过程图,次级精母细胞,初级精母细胞

精子发生是睾丸曲精小管中的原始生殖细胞经过高度复杂的细胞分裂和细胞逡逑分化过程，在男性性腺睾丸中完成。该过程主要分为有丝分裂，减数分裂和精子逡逑形成三个阶段（如图１．１所示）。①有丝分裂期：位于生精小管基底膜附近的精逡逑原干细胞经过有丝分裂产生两种类型的细胞，即Ａ型细胞补充干细胞和Ｂ型细逡逑胞，Ａ型细胞不进入细胞分化途径，继续进行有丝分裂，Ｂ型细胞进入分化途径，逡逑分化为初级精母细胞。②减数分裂期：初级精母细胞经过第一次减数分裂形成两逡逑个次级精母细胞，每个次级精母细胞通过减数分裂第二次分裂形成两个相同的单逡逑倍体精子细胞。因此，初级精母细胞产生两个细胞，即次级精母细胞，两个次级逡逑精母细胞经过减数分裂产生四个精子细胞，由原来的二倍体细胞（２ｎ）变成单倍逡逑体细胞（Ｉｎ）。③精子形成期：圆形精子细胞经过变形形成流线型、有活动力的逡逑精子的过程。该过程主要包括，核染色质高度浓缩形成精子的头部，高尔基复合逡逑体形成顶体，中心体迁移到顶体对侧，中心粒形成轴丝，成为精子尾部的主要结逡逑构

过程,麦管,卵子,精子

图２．１微？精子冷冻过程逡逑２．邋３．邋２微量睾丸精子复苏逡逑（１）、如果患者取卵日有成熟的卵子，便可对提前冷冻的睾丸精子进行复苏，逡逑将冷冻麦管从液氮罐中取出，放置在室温下５ｍｍ，等冷冻标本完全溶解；逡逑⑵、剪开麦管，立即将冷冻标本打入到１５ｍｌ离心管中，在半分钟内加入５－１０逡逑倍体积的精子处理液Ｓｐｅｒｍｒｉｎｓｅ，充分混合均匀，进行微量密度梯度离心洗涤，逡逑共洗涤两次。离心后的沉淀中加入0．５ｍｌ精子处理液，重悬沉淀。逡逑⑶、取出５０微升悬浮液在倒置显微镜下观察是否有活动精子，如果有，可逡逑以在取卵后的４ｈ行ＩＣＳＩ治疗；如果没有活动精子或活动精子数量极少则重新行逡逑ＴＥＳＡ取精。逡逑２．邋４超促排卵和卵子获取逡逑

卵子,获取过程

逑中所有ＯＣＣＣ迅速转移到培养皿中。待捡出所有ＯＣＣＣ后，在体视镜下计数，逡逑放入６％Ｃ0２培养箱培养。（如图２．２所示）逡逑‘逦町Ｃ逡逑图２．邋２卵子获取过程逡逑２．４．３卵子脱颗粒逡逑⑴每位患者准备一个四孔皿，提前放到工作台上预温。提前将５％Ｇ－Ｍｏｐｓ逡逑适量加入四孔皿的三个孔中，每孔用量０．８－ｌｍｌ，上面封矿物油，放到无二氧化逡逑碳的培养箱内备用。逡逑⑵准备２根巴斯德管：第１根不需拉制，用于吸取５％Ｇ－Ｍｏｐｓ、透明质酸酶逡逑和ＯＣＣＣ；第２根拉制稍细，用于转移消化后卵子并脱掉近卵丘细胞，其直径约逡逑为１６０－１７０ｕｍ，不能损伤卵细胞。逡逑⑶准备开始消化ＯＣＣＣ逡逑①

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