谷氨酰胺和谷氨酸对小鼠成纤维细胞和人宫颈腺癌细胞差异代谢产物的研究

发布时间：2020-10-26 06:07

　　 细胞的生长需要大量的营养物质供应,谷氨酰胺对于细胞的生长和代谢有着至关重要的作用。小鼠成纤维(L)细胞和人宫颈腺癌(HeLa)细胞利用谷氨酰胺的研究可以追溯到20世纪50年代,有研究表明两株细胞在谷氨酰胺和谷氨酸的利用上存在着差异。本文考察了谷氨酰胺和谷氨酸对L细胞和He La细胞的作用差异,并建立了细胞代谢组学分析方法。利用这一方法分析L细胞和HeLa细胞在谷氨酰胺或谷氨酸培养条件下的代谢产物特征及变化规律,进一步阐明两株细胞利用谷氨酰胺或谷氨酸差异的原因。本文首先考察L细胞和HeLa细胞在生长过程中,对谷氨酰胺或谷氨酸的利用上所存在的差异。研究结果发现,L细胞和HeLa细胞在正常生长过程中,只有当培养基中的谷氨酰胺浓度达到2 mmol/L以上时,才能维持细胞的正常生长增殖。使用谷氨酸单钠替代培养基中的谷氨酰胺培养细胞时,20 mmol/L谷氨酸单钠可以维持HeLa细胞生长,却不足以维持L细胞生长。随后,对两种细胞的胞内氨基酸水平进行了测定,发现两株细胞内的11种氨基酸含量存在显著性差异。最后,考察了使用谷氨酸单钠替代谷氨酰胺培养两株细胞时,谷氨酰胺和谷氨酸代谢相关酶活性变化。结果表明HeLa细胞的谷氨酰胺代谢相关酶活性上升,而L细胞的对应酶活没有明显变化。其次,本文建立细胞的代谢组学分析方法,选取5种代表化合物考察方法的线性范围(0.02~200 mg/L)、相关系数(0.9949~0.9997)、检出限(0.001~0.002mg/L),方法回收率(88.7%~102.6%),结果表明该方法具有较高的灵敏度和准确度,用于细胞代谢组学分析时能够得到可靠的信息。最后,应用建立的细胞代谢组学分析方法,详细研究L细胞和HeLa细胞分别在谷氨酰胺或谷氨酸培养条件下,0 h、12 h、24 h、48 h、72 h这5个时间点,代谢产物的特征及变化规律。分析结果显示:L细胞和He La细胞在谷氨酰胺缺乏、添加谷氨酰胺、添加谷氨酸单钠的三种培养条件下,其胞内代谢产物轮廓图存在明显差异。通过多元统计学方法,筛选出L细胞和HeLa细胞分别在上述三种培养条件下的差异性代谢产物,主要包括糖类、碱基类、有机酸类等。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

图 1-1 代谢组学分析流程Fig. 1-1 Procedures of metabolomics analysis2.1.1 细胞样品的制备细胞样品的制备是代谢组学研究的初始步骤和关键步骤，制备的主要步骤包括细灭和代谢物提取[53]。理想的淬灭处理应该在胞内代谢物不泄漏的前提下使得胞内酶失活，代谢变化停止[54]。对于细胞样品处理的要求主要是简便、快速、重复性好，采用有机溶剂低温处理[55]。Lauri 等[56]在对人结肠癌 HCT116 细胞的代谢物分析时液氮淬灭，其优点是速度快且不发生胞内物泄漏。淬灭前须用磷酸缓冲（PBS）溶细胞进行多次清洗以去除培养液等基质的残留。Zhang 等[57]在针对人的心肌 AC16的研究中发现，用预冷的 PBS 溶液淬灭方式不伤害细胞，有效遏制了胞内物的泄代谢物具有不同的物理和化学性质，理想的提取方法应尽可能多的把胞内所有代提取出来，定量效果好且有良好的重复性。液-液萃取法是最为广泛使用的方法，萃取剂有甲醇、乙腈、氯仿等。García-Ca averas 等[58]以人肝癌 HepG2 细胞为研究，探究贴壁生长的哺乳动物细胞代谢组学分析中可优化的步骤，比较代谢物提取剂

图 3-1（b）不同浓度谷氨酰胺培养 HeLa 细胞 24 h、48 h、72 h 对细胞形态的影响ig. 3-1（b）Effects of different concentrations of Glutamine for 24h, 48h, 72h on HeLa celluproliferation如图 3-1 (a) 结果所示，随着谷氨酰胺浓度的改变，L 细胞的形态和数目都。随着谷氨酰胺浓度的降低，原本梭状的 L 细胞形态变得不规则，细胞发生数目减少，细胞变圆从皿底脱落并悬浮于培养基中。当谷氨酰胺浓度为 0 m几乎无贴壁细胞，表明细胞已经漂浮死亡。随着培养时间的延长，能够发现度为 0.5 mmol/L、1 mmol/L 的各组，细胞数目远少于 2 mmol/L 和 4 mmol/L 量为 0.5 mmol/L、1 mmol/L 组在 24 h、48 h 细胞数目维持在增加的状态，但再增加，说明 L 细胞的生长对谷氨酰胺可能存在着剂量依赖关系。正常生长的 HeLa 细胞呈相对规则的多角形，细胞大小均匀，生长迅速，贴无脱落。如图 3-1 (b) 结果所示，HeLa 细胞也随着谷氨酰胺浓度的变化，其都发生了改变。随着谷氨酰胺浓度的降低，HeLa 细胞形态变得不规则，细。与 L 细胞的结果相似，当谷氨酰胺浓度为 0 mmol/L 时，HeLa 细胞变圆从悬浮于培养基中，几乎无贴壁细胞。随着培养时间的延长，谷氨酰胺浓度低的

3.1.1.2 谷氨酰胺对 L 细胞和 HeLa 细胞增殖的影响MTT 实验是一种检测细胞增殖的常用方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），因其不溶于水而沉积在细胞中。使用二甲亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪测定 570 nm 波长处的吸光度值，在一定范围内，蓝紫色甲瓒结晶形成的量与细胞增殖水平成正比，并可间接反映活细胞数量。为进一步验证谷氨酰胺在 L 细胞和 HeLa 细胞正常生长增殖过程中的作用，采用含不同浓度谷氨酰胺的培养基培养细胞，以正常 DMEM 培养基培养细胞为对照组，分别培养 24 h、48 h、72 h 后，用 MTT 实验测定吸光度值。结果如下图 3-2 所示，随着谷氨酰胺浓度的升高，L 细胞和 HeLa 细胞的增殖水平也随之发生改变：谷氨酰胺浓度在 0 -2 mmol/L 范围内时，L 细胞和 HeLa 细胞的增殖水平均随着谷氨酰胺浓度的增加而上升，这与显微镜下细胞拍照结果相同；当谷氨酰胺浓度达到 2 mmol/L 以上时，L 细胞和 HeLa细胞的细胞增殖水平均达到与正常对照组相同。横向比较 24 h、48 h、72 h 三个时间点的细胞增殖水平时发现，L 细胞和 HeLa 细胞在谷氨酰胺浓度为 0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 三个组别的细胞增殖水平随着培养时间的延长而降低。
【参考文献】

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本文编号：2856611