UPF1在子宫内膜样癌中的表达及对mTOR信号通路的影响

发布时间：2020-11-06 18:39

　　 研究背景子宫内膜样癌(Endometrial endometrioid carcinoma,EEC)是最常见的恶性妇科肿瘤之一。EEC可以分成不同的子类型并表现出独特的病理和不同的生物学行为。而UPF1是无义介导的mRNA降解途径(NMD)中的关键蛋白因子,在肿瘤中的作用尚待研究。因此本课题希望对UPF1在子宫内膜样癌发病机制和迁移侵袭的研究,能进一步了解子宫内膜样癌的发病机制,从而对临床治疗及诊断提供帮助。目的:1.检测EEC组织及癌旁组织和不同来源的EEC细胞系中UPF1的RNA表达水平;2.验证UPF1对EEC细胞功能的影响;3.裸鼠皮下成瘤验证UPF1对成瘤能力的影响;4.探讨UPF1影响mTOR信号通路。方法:1.首先采用qRT-PCR检测人新鲜EEC组织及癌旁组织和EEC细胞株中UPF1的RNA表达水平;2.免疫组织化学方法检测EEC组织与癌旁组织中UPF1的表达水平;3.构建UPF1过表达质粒,瞬时转染促进EEC细胞株(RL952、ishikawa)UPF1的表达;设计siUPF1抑制EEC细胞株(RL952、ishikawa)中UPF1的表达;4.生物学功能实验检测:通过瞬时转染UPF1过表达质粒及siUPF1抑制UPF1表达后,检测EEC细胞生物学行为的改变;(1)采用流式细胞术检测过表达UPF1及抑制UPF1表达siUPF1后细胞周期及凋亡的情况;(2)采用CCK-8检测EEC细胞生长曲线的改变;(3)采用细胞划痕及Transwell迁移与侵袭实验检测过表达UPF1及抑制UPF1表达对EEC细胞迁移与侵袭能力的影响;5.Western blot检测改变EEC细胞株中UPF1表达后对mTOR及下游蛋白(p70s6k/p-p70s6k)表达的影响;6.构建细胞稳转株进行裸鼠皮下成瘤实验;7.统计学分析结果:1.qRT-PCR检测发现UPF1在EEC组织中的RNA表达水平较癌旁组织中高表达。2.细胞功能试验研究表明UPF1可以促进EEC细胞增殖、侵袭迁移的能力,及抑制UPF1表达可以抑制EEC细胞的增殖、侵袭及迁移能力。3.抑制UPF1表达能够抑制裸鼠皮下成瘤生长速度;4.Western blot结果显示UPF1可以通过上调mTOR,激活mTOR/p70s6k/p-p70s6k信号通路,及通过激活mTOR促进细胞增殖能力。结论:1.UPF1在EEC组织较癌旁组织中高表达;2.UPF1在EEC中作为促癌基因可以促进EEC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡率;3.在裸鼠实验中,抑制UPF1的表达可以抑制肿瘤的生长;4.UPF1能使mTOR表达上调并激活mTOR信号通路促进细胞增殖能力。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

图 1.1UPF1 在人子宫内膜样腺癌组织（T）与癌旁正常组织（N）中的表达水平；图 A、B、C.42 对组织中癌（T）与癌旁（N）UPF1 的表达水平，*p＜0.05,**p 和***p＜0.01；图 D（20倍镜）.IHC 检测 UPF1 在 EEC 中的表达，癌（T）与癌旁（N）对比，UPF1 在癌中的表达明显高于癌旁正常腺体。1.2UPF1 在子宫内膜样腺癌细胞株中的表达通过 qRT-PCR 及 western blot 检测在不同 EEC 细胞株中 UPF1 的表达水平，结果显示 UPF1 在 ishikawa 中的表达最高，在 RL952、HEC-1B 细胞中的表达较低；结果如图 1.2 所示：

图 1.1UPF1 在人子宫内膜样腺癌组织（T）与癌旁正常组织（N）中的表达水平；图 A、C.42 对组织中癌（T）与癌旁（N）UPF1 的表达水平，*p＜0.05,**p 和***p＜0.01；图 D（倍镜）.IHC 检测 UPF1 在 EEC 中的表达，癌（T）与癌旁（N）对比，UPF1 在癌中的表明显高于癌旁正常腺体。1.2UPF1 在子宫内膜样腺癌细胞株中的表达通过 qRT-PCR 及 western blot 检测在不同 EEC 细胞株中 UPF1 的表达水平结果显示 UPF1 在 ishikawa 中的表达最高，在 RL952、HEC-1B 细胞中的表达低；结果如图 1.2 所示：

广州医科大学硕士学位论文 2.UPF1 过表达质粒转染细胞后能有效提高 UPF1 的表达量，siUPF1 能有效抑制UPF1 的表达通过 qRT-PCR 及 western blot 已经验证 UPF1 在 EEC 细胞株 HEC-1B、JEC、ishikawa、RL952 中的表达水平。构建好 UPF1 过表达质粒，瞬时转染 ishikawa、RL952 细胞株检测转染效率，与对照组 pcDNA3.1 相比，过表达质粒可有效提高UPF1 的表达量，如图 2A；三组 siUPF1 抑制 UPF1 的表达，分别转染 48h 后ishikawa、RL952 细胞，检测 siUPF1-1、siUPF1-2 及 siUPF1-3 组的 UPF1 表达量，与 NC 组相比，三种 siRNA 表达有差异，选出抑制效果最佳的 siUPF1-1 进行后续细胞实验如图 2B。A
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本文编号：2873515