卵巢癌相关circRNA的筛选及circHIPK3功能和机制的初步研究

发布时间：2020-11-12 23:34

　　 背景随着高通量测序技术的发展,越来越多的环状RNA(circular RNA,circRNA)新分子被发现。多个circRNA被报道在恶性肿瘤的进展中发挥重要作用,然而circRNA在卵巢癌中的研究甚少。本研究对卵巢癌中的差异circRNA表达谱及其中circHIPK3的功能和作用机制进行分析。方法本研究利用高通量测序技术分析了上皮性卵巢癌组织(epithelial ovarian cancer,EOC)及正常卵巢上皮组织(normal ovarian tissues,NOT)中差异表达的circRNA表达谱。随后根据表达丰度高及组间差异大的原则选择六条circRNA,采用qRT-PCR(quantitative real-time-PCR,qRT-PCR)、RNase实验及RT-PCR(reverse-transcription PCR,RT-PCR)后的Sanger测序进行验证。而后选择测序结果中表达丰度最高的circHIPK3行功能研究,合成circHIPK3特异性的siRNA并证明其可有效沉默circHIPK3的表达后,分别利用划痕实验、Transwell小室实验、CCK8细胞存活实验(cell counting-kit 8)及流式细胞技术分析上皮性卵巢癌细胞A2780及SKOV3的迁移、侵袭、增殖及凋亡功能。结合高通量测序结果、生物信息学分析及基于已有卵巢癌数据库的生存曲线分析对circHIPK3的作用机制进行了预测。结果利用高通量测序,我们共筛选出7333条circRNA,4505条(61.43%)新的circRNA分子被测序获得,在上皮性卵巢癌中高表达的circRNA有2431条,差异低表达的有3120条。对选择的六条circRNA:circHIPK3(circBase编号:hsa_circ_0000284)、circRHOBTB3(hsa_circ_0007444)、circPCMTD1(hsa_circ_0001801)、circSETD3(hsa_circ_0000567)、circATRNL1(hsa_circ_0020093)及hsa_circRNA003397(本研究首次发现,circbase未报道)进行验证。利用RNase实验及RT-PCR后的Sanger测序验证了六条circRNA的成环性,采用qRT-PCR在18例上皮性卵巢癌组织及18例正常卵巢组织中验证了表达,结果表明六条circRNA均可成环,表达趋势及反向交接口处的碱基序列与高通量测序结果一致。沉默circHIPK3后促进了卵巢癌细胞的迁移、侵袭及增殖,抑制了其凋亡。生物信息学分析预测发现,circHIPK3可能通过circHIPK3-miRNA-mRNA的ceRNA(competing endogenous RNA,ceRNA)机制在卵巢癌中发挥调控作用。结论本研究分析了卵巢癌中的circRNA表达谱,并进一步验证了六条circRNA的表达及成环性。另外选择表达丰度最高的circHIPK3进行功能研究,发现沉默circHIPK3后促进了卵巢癌上皮细胞的恶性行为。通过生物信息学分析预测circHIPK3可能通过ceRNA机制在卵巢癌中发挥调控功能。因此,我们认为circHIPK3是卵巢癌恶性进展中重要的调节分子。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：

图 1 上皮性卵巢癌组织以及正常卵巢组织中差异 circRNA 表达谱分析A：差异表达的 circRNA 散点图，红点表示在癌中高表达的 circRNA，而绿点表示低表达的 circRNA，表达差异倍数大于两倍且 FDR < 0.05；B：在上皮性卵巢癌组织及正常卵巢组织中特异性表达的 circRNA，仅 3414 个 circRNA 在两组

图 2 差异表达 circRNA 来源亲本基因的 GO 分析红色部分：生物学功能；蓝色部分：分子功能；绿色部分：细胞成分。4. 差异表达 circRNA 亲本基因的 pathway 分析进一步行 pathway 分析提示亲本基因的产物参与到多个信号通路中。图 3列出了排名前 20 的信号通路，与上皮性卵巢癌相关通路包括泛素化介导的蛋白

差异表达circRNA来源亲本基因的pathway分析
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本文编号：2881388