大鼠脂肪源干细胞的分离培养鉴定及Myocardin基因重组慢病毒载体的构建

发布时间：2017-11-08 03:00

  本文关键词：大鼠脂肪源干细胞的分离培养鉴定及Myocardin基因重组慢病毒载体的构建

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【摘要】：研究背景 勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是成年男性最常见的性功能障碍,随着年龄的增加和基础疾病的增多ED的发病率明显增高。糖尿病与ED的相关性早已被人们所认可,糖尿病人群发生ED的概率是非糖尿病人群的3倍,发病率达到35%-90%。糖尿病性ED的发生发展是一个复杂的过程,因此其在治疗上存在巨大的困难,很大一部分糖尿病性ED患者对一线药物(磷酸二酯酶抑制剂)不敏感,而又不能或不愿意接受二线和三线治疗方案,因此,进一步研究糖尿病性ED的病理生理、寻找其他有效的治疗措施、发展个体化治疗具有重要的意义。在阴茎勃起过程中,阴茎海绵体平滑肌作为各种因素作用的终末组织,具有重要的核心地位。有研究表明,糖尿病患者阴茎海绵体平滑肌细胞发生细胞凋亡增加及增殖率降低,继而阴茎海绵体平滑肌细胞的数量明显减少,同时细胞超微结构发生病理变化,使阴茎海绵体组织顺应性下降,进而诱发ED。因此,增加糖尿病患者阴茎海绵体平滑肌细胞数量和修复细胞功能,改善阴茎海绵体组织功能可能作为提高糖尿病性ED防治水平的重要途径。 与心血管平滑肌细胞相似,阴茎海绵体平滑肌细胞根据结构和功能的不同可分为收缩型和增殖型。收缩型细胞主要功能是控制细胞的收缩和舒张,维持组织器官正常形态结构和功能,增殖型细胞主要功能是细胞的增生、分泌、迁移及降解胞外蛋白等。阴茎海绵体组织是一种特殊的血管组织,由两个较大的血窦组成,血窦的小梁中平滑肌细胞和心血管平滑肌细胞在功能上非常相似。本课题组近年来发现在糖尿病性ED组大鼠阴茎海绵体组织及其体外培养平滑肌细胞中海绵体平滑肌细胞发生表型转化,由收缩型转化为增殖型,细胞舒缩功能受损。 干细胞(stem cell)是具有多向分化潜能和自我复制功能的未分化细胞的统称,按其来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。脂肪干细胞(adipose derived stem cell, ADSCs)是成体干细胞的一种,具有分化为多种细胞的潜能,在特定条件下可被诱导分化为骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、肌肉细胞及血管内皮细胞等。ADSCs具有取材容易、获得率高、对组织损伤较小等优点,因此在再生医学中占据重要的地位,可为组织工程提供可靠的细胞来源,为临床应用奠定坚实的基础。 Myocardin又称为心肌素,是一种核受体转录因子,在平滑肌细胞分化过程中发挥重要的调控作用,Myocardin直接与血清效应因子(serum response factor, SRF)相结合,激活一系列受SRF调控、可编码细胞骨架蛋白和收缩蛋白的基因转录。最近研究表明,Myocardin对脂肪源干细胞分化也起作用,经过Myocardin基因修饰后的脂肪源干细胞可以向具有舒缩功能的平滑肌样细胞分化,因此课题组希望进一步研究：通过转基因的方法,选择合适的表达载体,将Myocardin基因导入大鼠ADSCs中,使其在细胞内长期、稳定地表达,并将修饰后的ADSCs作为种子细胞移植到大鼠阴茎海绵体内,能否在改善治疗区域细胞外环境和局部组织功能的同时,又能发挥ADSCs的多向分化潜能,在Myocardin的作用下分化为具有舒缩功能的平滑肌样细胞,通过增加阴茎海绵体平滑肌细胞数量及修复细胞舒缩功能,有望进一步改善糖尿病性ED大鼠阴茎勃起功能。在进行动物实验之前,首先需要具备成熟脂肪干细胞培养技术,在短期内能获得大量纯度高、活性强、适合进行基因转染的细胞,其次需要构建稳定可靠的过表达大鼠Myocardin基因重组慢病毒载体,本课结合国内外同行的经验,根据课题组的需要,总结出了一套较为成熟的大鼠脂肪源干细胞的分离、培养及鉴定的方法,并成功构建大鼠Myocardin基因重组慢病毒载体,为课题组进一步的研究工作奠定了坚实的基础。 目的 1、以SD大鼠为研究对象,旨在从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞(ADSCs),并通过体外培养观察其生长形态,生长方式以及生长曲线等生物学特征,诱导其定向分化,并检测分化相关标记物予以鉴定,建立大鼠脂肪干细胞的培养模型。 2、通过病毒包装建立大鼠Myocardin基因重组慢病毒载体,为后续的工作打下良好基础。 方法 1.大鼠脂肪干细胞的原代培养 取8周龄SPF级雄性SD大鼠1只,麻醉后采用附睾旁取材法取附睾旁脂肪组织,取材后缝合切口,可继续饲养动物,去除肉眼可见血管、筋膜组织,PBS漂洗、剪碎后加入2倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶,37℃、120r/min震荡消化60min,用等体积含10%FBS的DMEM终止消化,1500r/min离心8min,弃上清和消化未完全的脂肪组织,沉淀物用含10%FBS的DMEM培养基重悬后,用100um细胞筛网过滤以除去细胞团块。收集滤液,细胞接种于25cm2培养瓶中,在标准环境下培养。24h后首次更换培养基,除去未贴壁细胞和剩余血细胞,后每2-3d换液一次,每日在显微镜下观察细胞形态、生长状况,并予以拍照。 2、大鼠ADSCs的传代培养 细胞长满培养瓶底80%时,用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,制成细胞悬液。用计数板计数细胞悬液浓度,以合适细胞浓度,通常为1×105-3×105个/m1,接种于2-3个新培养瓶或培养皿中,即按照1：3传代培养。 3、MTT法检测大鼠ADSCs的增殖 取生长满培养瓶底80%时的第3、6代ADSCs,消化离心,以1×103～1×104/孔密度接种于96孔板上,自接种后24h每d取出其中3孔进行MTT比色,连续7d,每隔3d换液1次。以时间为横轴、0D平均值为纵轴绘制生长曲线。 4、大鼠ADSCs的冻存和复苏 取生长满培养瓶底80%时的第3代ADSCs,消化离心后加入冻存管中,细胞密度为5×105/m1,冻存液配制比例为DMSO:胎牛血清：基础培养液=1：2：7。4℃放置1h,-20℃放置2h,-80℃放置过夜,保存在液氮中。1个月后复苏,将冻存管从液氮中取出,立即置于37℃水浴并轻轻摇动使其迅速解冻。加入基础培养液稀释、离心、去上清2次,接种至培养瓶内,并进行存活率测定(即用0.4%台盼蓝染液测定),成骨、成脂诱导分化等实验。 5、多向分化潜能检测 用特定的体外诱导培养体系诱导ADSCs向成骨细胞和脂肪细胞两个方向分化,并分别采用茜素红染色及油红0染色鉴定定向分化结果。 6、ADSCs表面分子的检测 取生长状态良好的第3代ADSCs,制成单细胞悬液,密度为1×106个/m1,加入兔抗鼠CD29-PE、CD44-FITC单克隆抗体工作液100u1,设立对照,流式细胞仪检测细胞表面分子,EXP032.V1.2软件分析。 7、大鼠Myocardin基因重组慢病毒载体的构建 采用全基因合成的方法人工合成全长序列为2832bp的目的基因大鼠Myocardin基因,构建并鉴定重组质粒pLVX-IRES-Neo-myocardin。大量提取pLVX-IRES-Neo-myocardin质粒,将携带目的基因大鼠myocardin的慢病毒表达质粒转染至293T细胞可包装出含有目的基因的慢病毒颗粒lenti-myocardin。测定慢病毒颗粒Lenti-myocardin滴度,并将慢病毒颗粒转染至大鼠ADSCs,通过RT-PCR和Western blot技术,检测大鼠Myocardin基因在大鼠ADSCs中mRNA和蛋白水平的过表达效果。 结果 1、大鼠ADSCs的细胞形态学观察 在倒置显微镜下观察,原代大鼠ADSCs接种后4-6小时开始贴壁,24h内多数已贴壁并开始伸展,7d左右,镜下可见大量成纤维样细胞的生长并且细胞排列具有一定的方向性,8d左右细胞可达80%～90%单层融合,传代后细胞呈梭形,突起减少,细胞大小及形态较为一致,增殖速度比原代细胞迅速,一般3～4d即可形成80%单层融合,细胞仍呈成纤维细胞样生长,呈束状及漩涡状排列。传6代后,细胞仍呈束状及漩涡状排列,增生活跃,传10代以后,细胞的增殖速度未见明显减慢,细胞仍然保持旺盛的增殖能力和均一的长梭样形态学特征,未见细胞在传代过程中自发形成胞浆内脂滴。 2、大鼠ADSCs生长曲线绘制 第3、5、7代大鼠ADSC生长曲线均呈“S”形,均在第1、2d为生长适应期,2d后细胞生长加速,呈对数增长,第6d达到生长峰值后,细胞增殖速率下降,进入平台期,第3、5代大鼠ADSCs增殖速率较第7代快。 3、大鼠ADSCs的冻存和复苏 1个月后将冻存的第3代ADSCs复苏,测定细胞存活率为79%,复苏后细胞生长形态良好,呈长梭形成纤维样生长,培养至第3d即可传代,增殖能力与冻存前相比无明显降低,成脂和成骨诱导分化也获得成功。 4、多向分化潜能检测 成骨诱导14d后,倒置显微镜下观察可见多数细胞形态发生变化,多由长梭形变为短梭形,出现椭圆形和多角形细胞,细胞核变大变圆,胞浆中可见较多的细小黑色颗粒细胞,形成大小不一的颗粒状结节。取成骨诱导28d后的细胞经茜素红染色可见：在集落生长的细胞中央区,细胞外基质中出现黑色团块状磷酸盐沉淀,对照组茜素红染色阴性。 成脂诱导7d后,倒置显微镜下可见少量细胞的胞浆内出现高折光性的圆形小脂滴,细胞形态发生改变,由原来的长梭形逐渐变圆。随诱导时间的延长,出现脂滴的细胞逐渐增多。诱导14d后,细胞体积增大,胞浆内充满圆形脂滴,行油红0染色可见：圆形细胞内出现红色的颗粒,证明胞浆内容物为脂肪滴。对照组无明显变化,仍为梭形细胞成纤维样生长,未见胞浆内脂滴,油红0染色阴性。 5、ADSCs的表面分子检测 大鼠ADSCs进行CD29.CD44分子流式细胞仪检测,可见ADSCs中CD29和CD44分子阳性率高,CD29阳性率87.2%、CD44阳性率93.5%。 6、大鼠Myocardin基因重组慢病毒载体的构建 结果显示大鼠myocardin蛋白在大鼠脂肪源干细胞成功过表达,同时说明了携带大鼠myocardin基因的慢病毒颗粒Lenti-myocardin已构建成功。 结论 1、附睾旁脂肪组织取材法优于其他部位的取材法,易于取得大量的ADSCs,所取组织不易受到细菌污染,可多只动物同时取材； 2、本实验所分离的大鼠ADSCs生长形态良好,与文献报道一致； 3、经形态学、干细胞表面标记物检测以及定向分化诱导实验鉴定,所分离的细胞为大鼠ADSCs; 4、通过绘制细胞生长曲线、观察传代后各代细胞生长速度及形态可得出结论：第3、5代大鼠ADSCs增殖速率较第7代快,因此3-5代大鼠ADSCs较适合在大规模动物实验中使用； 5、成功构建了携带大鼠Myocardin基因的慢病毒载体。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

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