PNPase调控MitomiRs对线粒体DNA氧化损伤的影响

发布时间：2021-03-09 20:23

  [背景和目的]：线粒体是真核细胞内重要的细胞器，其主要功能包括通过氧化磷酸化产生ATP，也参与细胞内其它生命活动的信号转导过程。线粒体拥有自身的遗传物质－线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)。mtDNA中有13个多肽编码基因存在，可编码13个相关功能蛋白，这些蛋白可参与合成线粒体呼吸链酶复合物。mtDNA中还包括了可编码22个tRNA以及2个rRNA的基因。mtDNA的转录、复制还可能受线粒体microRNA(MitomiRS)的调控，MitomiRS表达变化可能导致线粒体结构及功能的改变。 MicroRNAs(microRNAs)长约22至25nt，由核基因组编码，microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对构成基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)降解mRNA或阻碍其翻译而发挥作用。microRNAs在特定的组织（特异性）及特定的发育阶段（时序性）表达，导致了其在生物体功能中起到的特殊性作用，如microRNA进入线粒体后可能会调节mtDNA的表达，而mtDNA的延缓性损害可以延缓细胞衰老的过程，因此这也提示了microRNA在调控细胞以及组织生长发育发展过程中有着不可替代的作用。 多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide Phosphorylase，PNPase)存在于线粒体膜间隙(intermembrane space，，IMS)，是一种高度保守的3’—5’核糖核酸外切酶，依靠磷酸化作用降解RNA。此外，PNPase介导细胞核编码的microRNA输入线粒体。因此推测：调控PNPase可能导致MitomiRS表达谱变化，进而引起线粒体结构及功能的变化。 本研究旨在：①通过shRNA技术下调肿瘤细胞PNPase表达，检测线粒体microRNA(MitomiRs)表达谱的变化。②MitomiRs变化对线粒体DNA损伤的影响。③采用生物信息学预测差异表达的MitomiRs的功能。 [实验方法] 1、构建PNPase shRNA慢病毒载体、细胞转染。选取人肝癌细胞SK-Hep1、HepG2及人骨肉瘤细胞U2OS三种细胞系，将构建好的带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转染到目的细胞中，采用荧光显微镜观测和western-blot方法检测PNPase shRNA效果。 2、 MitomiRs芯片检测：抽提目的细胞线粒体，再提出线粒体RNA，采用miRNA芯片筛选抑制PNPase表达前后细胞中差异表达的MitomiRs,以信号值3、2倍法(foldchange=2)作为MitomiRs差异筛选标准，GeneSpring GX软件分析microRNA芯片得到的数据。采用实时定量基因扩增荧光检测系统(real-time quantitative PCR detectingsystem,Q-PCR)检测线粒体DNA(mitochondril DNA, mtDNA)的损伤频率；采用酶联免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测线粒体氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)的变化情况。 3、生物信息学预测：在TargetScan、miRanda、PicTar、MirTarget2、PITA五个生物功能信息数据库中同时对差异表达的MitomiRs对应的靶基因进行预测；同时在三个或三个以上数据库中具有生物学意义的MitomiRs靶基因纳入后续功能分析；利用DAVID功能注释基因芯片生物信息学分析软件(DAVID Functional AnnotationBioinformatics Microarray Analysis)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)预测线粒体相关MitomiRs靶基因(GO分析)，以及与这些MitomiRs相关的信号通路(Pathway分析)。 [实验结果] 1、采用分子克隆技术成功地构建了PNPase shRNA慢病毒表达载体，并转染人肝细胞癌细胞SK-Hep1、Hep G2以及人骨肉瘤细胞U2OS。 2、SK-Hep1、HepG2和U2OS细胞转染空载体病毒及PNPase shRNA慢病毒12～24小时后可见明显的绿色荧光。当MOI(转染复数)=20时，3种细胞的慢病毒转染效率达到80％以上。连续观察1～2周，转染效率仍维持在70％~80％。 3、转染PNPase shRNA慢病毒细胞PNPase表达显著低于空白对照组及阴性对照组(p0.05)，而空白对照组和阴性对照组PNPase表达无显著差异(p0.05)。 4、SK-Hep1-shPNPase、Hep G2-shPNPase、U2OS-shPNPase组细胞线粒体DNA的损伤频率较空白对照组及阴性对照组显著减少(P0.05)。 5、SK-Hep1-shPNPase、Hep G2-shPNPase、U2OS-shPNPase组细胞氧化损伤产物8-OHdG的检测量明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。 6、MicroRNA芯片差异筛选结果显示(信号值≥3,foldchange≥2)：在SK-Hep1、Hep G2及U2OS三种细胞系中， sh-PNPase组细胞表达下调的MitomiRs有hsa-miR-3934-5p、 hsa-miR-5010-3p、 hsa-miR-3154等16个，表达上调的MitomiRs有hsa-miR-1973、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-5010-3p等31个。通过TargetScan等五个靶基因数据库的同时预测，发现这些差异表达的MitomiRs，如mir-3154、mir-34a-3p、mir-4312、mir-98-3p等涉及的靶基因主要有： CASP(apoptosis-related cysteine peptidase)、CARD(caspase recruitment domain family)、 CAAP(caspase activity and apoptosisinhibitor)、AVEN(apoptosis, caspase activation inhibitor)、Fas、FADD(Fas-associated viadeath domain)等。主要的靶基因功能包括：DNA损伤反应、转录调节、抗凋亡调节、膜稳定性等。主要涉及的信号通路有：细胞凋亡、ErbB信号通路、MAPK信号通路等。这些靶基因可通过Fas—FADD—CASP/CARD/CAAP/AVEN—Mitochondria路径来保护mtDNA和影响线粒体功能。 [结论] 抑制细胞PNPase的表达可引起MitomiRs表达谱发生显著变化；MitomiRs表达变化可能影响线粒体DNA氧化损伤。因此，PNPase可能通过调控MitomiRs参与了线粒体DNA氧化损伤的调节。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416

【参考文献】

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1 文蕾;凌贤龙;周源;;端粒酶线粒体转位与肝癌细胞多药耐药的相关性研究[J];肿瘤;2012年01期

本文编号：1206253