Cpne5基因在脑发育中的功能初步研究

发布时间：2018-06-04 06:17

  本文选题：Cpne5 + 神经发育　； 参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2010年博士论文

【摘要】： Cpne5(CopineV)属于copines家族成员之一,该家族成员在进化过程中高度保守且分布广泛,从线虫到哺乳动物都发现了copines蛋白的存在,哺乳动物中的copines家族共有8个成员,依次被命名为copineⅠ-Ⅷ。进化的高度保守性和分布的广泛性预示着copines家族可能具有重要的生物学功能。目前,尚未见到其他实验室对Cpne5(CopineV)的研究报道。本研究主要围绕Cpne5蛋白的多克隆抗体制备,组织表达分析,及其在小鼠脑发育过程中的生物学功能展开研究。 人CPNE5基因是从胎脑中分离出的一个新的神经发育相关基因,定位于6p21.1,全长3897bp,包含一个1782bp的完整开放读码框,编码含有593个氨基酸的蛋白。小鼠Cpne5基因有21个外显子,位于17A3.3,全长4420bp,也包含一个1782bp的完整开放读码框,编码含有593个氨基酸的蛋白。人CPNE5和小鼠Cpne5的蛋白序列一致性达到98%。Cpne5与该家族其他成员一样,在N端有2个蛋白激酶C保守结构域,被称为C2 domain,是Ca2+依赖性磷脂结合结构域;C端具有1个von Willebrand A (VWA)结构域,简称A domain,与整合素(integrin)胞外区的VWFA结构域具有很高的序列一致性,是与其他蛋白相互作用的区域,这提示Cpne5是一个钙依赖的膜结合蛋白。进一步序列分析发现该蛋白无信号肽和核定位信号,提示Cpne5应为胞浆蛋白。 为了分析Cpne5的表达分布,我们首先制备了抗Cpne5蛋白的兔多克隆抗体,免疫荧光和免疫印迹实验证实自制的Cpne5多克隆抗体能识别Cpne5蛋白并具有较好的特异性,能用于后续实验中对Cpne5蛋白的检测。 我们首先利用RT-PCR的方法检测了Cpne5 mRNA在胎脑中的表达,结果显示Cpne5在胚胎期9.5d(E9.5d)就有表达,表达量随胎龄增加而增高。免疫印迹检测结果显示Cpne5在除了脑组织外的其它主要脏器都有表达,而在新生12h乳鼠脑组织中有表达,这证实Cpne5参与脑发育过程。为了进一步明确Cpne5在胎脑中的表达分布及定位,我们分别利用原位杂交和免疫组织化学技术检测了Cpne5在胎脑组织中的表达,结果表明Cpne5主要表达于胎脑脑室区(ventricular zone,VZ),进一步检测结果表明Cpne5在VZ区的新生神经元和神经前体细胞中都有表达,这提示Cpne5可能参与VZ区神经细胞发生。为了证实这一推测,我们建立小鼠子宫内电转技术,构建了针对Cpne5的shRNA表达载体,然后利用该技术敲低了胎脑VZ区神经细胞的Cpne5表达;同时用人GFP-CPNE5真核表达载体转染胎脑VZ区神经细胞,过表达CPNE5,冰冻切片分析结果显示,敲低Cpne5表达能显著增增加迁移到边缘层的神经元数目;而过表达人CPNE5能显著减少迁移到边缘层的神经元数目,这提示Cpne5可能作为一个细胞内的负调控因子而参与VZ区神经元放射状迁移的过程。 生物信息学分析结果提示Cpne5是一个钙离子依赖的磷脂结合蛋白,钙离子在神经发生过程中发挥重要作用,因此我们进行了Cpne5的钙离子结合实验,结果表明内源性的和外源性的Cpne5均具有钙离子结合能力,在HEK293细胞中过表达人CPNE5能显著降低细胞内Ca2+浓度,这提示Cpne5可能通过调控胞浆内钙离子浓度而调控神经元放射状迁移。 为了进一步明确Cpne5在脑发育中的功能,我们制备了Cpne5基因敲除小鼠模型,目前正在繁殖阶段,杂合子未表现出任何明显症状,这可能是因为杂合子小鼠中Cpne5的另一个等位基因未被删除而发挥代偿作用。 综上所述,我们制备了Cpne5多克隆抗体,对Cpne5在小鼠各组织及胎脑组织的表达分布进行了研究,证实了Cpne5在胎脑发育过程中发挥作用;进一步通过子宫内电转技术,分别敲低和过表达胎鼠胎脑VZ区神经细胞Cpne5,证实Cpne5在神经神经元迁移过程中发挥作用;目前,我们已经获得了Cpne5基因敲除小鼠杂合子,该敲除小鼠模型的建立将有助于对Cpne5功能进行更加深入的研究。
[Abstract]:Cpne5 ( Copine V ) belongs to one of the members of the copines family . The family members are highly conserved and widely distributed in evolution . The family members of copines in mammals have been named copine 鈪，

本文编号：1976322