人骨髓间充质干细胞体外培养及成软骨诱导研究

发布时间：2018-07-13 11:50

【摘要】： 目的研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离纯化、体外培养、扩增和成软骨分化的现象与规律以及转化生长因子β_1对MSCs成软骨分化的影响。探讨在体外单层培养条件下,不同浓度转化生长因子β_1(TGF-β_1)对诱导人骨髓MSCs向软骨细胞分化的作用有无差异,找出最有利于人骨髓MSCs向软骨细胞分化的TGF-β_1浓度。为临床使用自体间充质干细胞移植修复软骨缺损提供技术基础和参考。方法在无菌条件下,从3名健康成年男性志愿者髂后上棘抽取5ml骨髓标本置于抗凝环境。用密度为1.077g/mL的Ficoll人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取有核细胞层,以5×10~6/cm~2密度接种于25ml细胞培养瓶,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基悬浮细胞,置于37℃含5%CO_2的细胞培养箱中培养。培养48小时后半量换液,弃去不贴壁的细胞。以后每2～3天换液一次,当细胞生长达到90%融合时按1∶3行传代培养。连续培养三代后MSCs基本纯化。取第三代MSCs接种96孔板,于传代后8天内每天取10孔行MTT检测,绘制细胞生长曲线。用含有不同浓度转化生长因子β_1的成软骨诱导培养基分别诱导第三代MSCs向软骨细胞方向分化,每日倒置相差显微镜下观察细胞形态。诱导培养三周后,各组细胞行甲苯胺兰染色、阿利新蓝染色,免疫荧光法检测Ⅱ型胶原表达,阿利新蓝比色法测定葡萄糖氨基聚糖(GAG)含量。最后统计分析各组间结果有无差异。结果(1)原代人骨髓MSCs细胞呈梭形,形态幼小细短,排列松散。随着细胞数量增加出现小细胞群落,细胞间排列逐渐紧密,出现典型长梭形细胞,培养10天后细胞达到909/6融合。传代后细胞生长速度加快,约7天左右细胞可长满瓶底,细胞呈漩涡状紧密排列。三代后细胞形态趋于一致,呈长梭形,细胞两端有长丝状伪足。(2)第三代MSCs有48小时左右的潜伏期,传代3天后细胞开始缓慢增殖,5天后扩增速度明显增加,5～7天细胞数量快速增加,排列逐渐规律,7天后细胞增殖进入平台期。(3)成软骨诱导前5天细胞形态变化不大,第2周细胞逐渐变得宽大扁平,向多角形及多分支样形态发展。空白对照组中观察到部分细胞发生空泡状变化,形态酷似脂肪细胞。诱导过程中细胞增殖速度较未诱导时明显减慢,约9天左右细胞数量增加1倍。(4)诱导3周后,行甲苯胺蓝染色,各组细胞染色结果有明显差异。空白对照组染色呈阴性,10μg/L、20μg/L组呈阳性,5μg/L组染色呈弱阳性。(5)阿利新蓝染色结果和甲苯胺蓝染色结果一致。(6)Ⅱ型胶原免疫荧光检测,结果显示各组间有明显差异。空白对照组无荧光,5μg/L组荧光微弱。10μg/L、20μg/L两组细细胞质中有红色荧光,同时细胞外也有细颗粒状淡染色荧光区域。(7)葡萄糖氨基聚糖(GAG)含量检测,各组间GAG含量有明显差异。5μg/L、10μg/L、20μg/L组的GAG含量均高于空白对照组,5μg/L、10μg/L、20μg/L组间GAG含量也各不相同,其差异有统计学意义。结论(1)用Ficoll分离液密度梯度离心法获得的人骨髓MSCs可以进行体外培养和扩增,细胞增生活跃,可以连续传代。(2)成软骨诱导过程中人MSCs增殖减慢,形态逐渐发生改变,向扁平宽大、多角多分支形态变化。(3)人骨髓MSCs在平面培养条件下可以发生软骨细胞分化,TGF-β_1是维持MSCs向软骨细胞方向分化的必要条件。(4)研究表明:不同浓度的TGF-β_1对于促进MSCs的成软骨分化作用效果不同,10μg/L为促进软骨分化的最佳浓度。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of transforming growth factor 尾 _ 1 ( TGF - 尾 _ 1 ) on the differentiation of human bone marrow MSCs into chondrocytes in vitro .

Methods The cells were cultured in 25 ml cell culture flask with density of 1.077 g / mL Ficoll human lymphocyte separation solution density gradient centrifugation .

Results ( 1 ) The bone marrow MSCs of the primary generation were spindle - shaped , small in shape and loose in arrangement . ( 7 ) Glucosamine ( GAG ) content was detected , GAG content in each group was significantly different . GAG content of 5 渭g / L , 10 渭g / L , 20 渭g / L group was higher than that in blank control group , 5 渭g / L , 10 渭g / L and 20 渭g / L group .

Conclusion ( 1 ) Human bone marrow MSCs can be cultured and expanded in vitro by Ficoll separation liquid density gradient centrifugation .
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

【参考文献】