RNA干扰阻断TGFβ1对人颞动脉炎的影响及其机制

发布时间：2018-11-15 14:48

【摘要】：目的:构建人TGFβ1基因的RNAi质粒载体,为进一步构建其RNAi病毒载体奠定基础。方法:根据人TGFβ1的mRNA序列选择3个靶序列并根据它们设计合成3对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连入pRNA-U6.2/Lenti质粒并分别命名为pRNA-U6.2/Lenti-1,pRNA-U6.2/Lenti-2,pRNA-U6.2/Lenti-3,pRNA-U6.2/Lenti-4。酶切和测序鉴定后,将以上重组质粒转染Hela细胞,运用RT-PCR和ELISA检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6.2/Lenti质粒;与对照组相比,pRNA-U6.2/Lenti-1,pRNA-U6.2/Lenti-2转染Hela细胞后,TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表达量均受到明显抑制;其中TGFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-1组下降79.2%,在pRNA-U6.2/Lenti-2组下降53.7%,统计有显著性差异(P0.01)。结论:成功构建了人TGFβ1基因的RNAi质粒载体,为进一步构建其RNAi病毒载体奠定了基础。目的:构建TGFβ1基因RNAi慢病毒载体,为因TGFβ1高表达而致病疾病的基因治疗奠定基础。方法:将第一章实验得到的最有效的干扰质粒pRNA-U6.2/Lenti-1和阴性对照质粒pRNA-U6.2/Lenti-4分别与包装质粒混合物共转染293FT细胞,包装产生病毒载体颗粒。各组病毒载体转染Hela细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:各pRNA-U6/Lenti质粒与包装质粒共转染293FT细胞后能产生高滴度的慢病毒载体颗粒;慢病毒载体感染Hela细胞后,pRNA-U6.2/Lenti-1可以显著地抑制TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表达,其中TGFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-1组下降90.7%,统计有显著性差异(P(0.01);阴性对照病毒pRNA-U6.2/Lenti-4对TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平无明显影响。结论:成功构建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒载体,为后续的针对人颞动脉炎的干预研究提供了良好的实验工具。目的:观察RNAi慢病毒载体pRNA-U6.2/Lenti-1阻断TGFβ1表达对人颞动脉炎的影响并探讨其可能机制。方法:将经病理活检确诊为颞动脉炎的每一例人颞动脉标本(共12例)平均分成4份,分别埋入4只SCID鼠腹部皮下,建立人颞动脉炎-严重联合免疫缺陷病小鼠嵌合体模型;模型随机分为对照组、pRNA-U6.2/Lenti-1干预组、地塞米松干预组、联合干预组(pRNA-U6.2/Lenti-1联合地塞米松)。对照组于皮下颞动脉处注射生理盐水(100ul);pRNA-U6.2/Lenti-1干预组于皮下颞动脉处注射针对TGFβ1的RNAi慢病毒载体pRNA-U6.2/Lenti-1(100ul,滴度3.1×10~7TU/ml);地塞米松干预组于皮下颞动脉处注射地塞米松(4mg/kg);联合治疗组于皮下颞动脉处注射pRNA-U6.2/Lenti-1(100ul,滴度3.1×10~7TU/ml)及地塞米松(4mg/kg),干预3周后获取颞动脉标本,采用光镜观察干预后各组人颞动脉炎的炎症细胞浸润程度及内膜增生程度的变化。运用免疫组化、RT-PCR、Western-blotting分别观察各组炎性颞动脉干预后TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2、MCP-1、ICAM-1、在mRNA及蛋白水平的变化。结果:1.与对照组相比,慢病毒载体pRNA-U6.2/Lenti-1干预后炎性颞动脉内膜增生程度减轻(P0.05);RT-PCR检测TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2在mRNA水平表达下降,Western-blotting检测TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2在蛋白水平表达下降(P0.05)。 2.与对照组相比,地塞米松干预后炎性颞动脉炎性细胞浸润程度减轻(P0.05);RT-PCR检测MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在mRNA水平表达下降,Western-blotting检测MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在蛋白水平表达下降(P0.05)。 3.pRNA-U6.2/Lenti-1及地塞米松联合干预后,炎性颞动脉炎性细胞浸润程度较对照组减轻(P0.05);炎性颞动脉内膜增生程度较对照组及pRNA-U6.2/Lenti-1干预组均减轻(P0.05)。与对照组比较,TGFβ1、PCNA、MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在mRNA及蛋白水平表达均下降(P0.05);与pRNA-U6.2/Lenti-1干预组比较,PCNA在mRNA水平及蛋白水平均下降(P0.05)。结论:1.慢病毒载体pRNA-U6.2/Lenti-1干预后,可能通过抑制TGFβ1进一步抑制平滑肌细胞增殖,使炎性颞动脉内膜增生程度减轻;此病毒载体联合地塞米松干预后,对平滑肌细胞的增殖可能产生协同抑制作用,更有利于减轻炎性颞动脉内膜增生程度。 2.TGFβ1不是致颞动脉炎性细胞浸润的主要因素,因此慢病毒载体pRNA-U6.2/Lenti-1治疗后,不能明显减轻颞动脉炎性细胞浸润程度。 3.慢病毒载体pRNA-U6.2/Lenti-1治疗后,CD4+T细胞功能下降,可能与TGFβ1下降后NF-KB水平降低有关。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

【参考文献】