转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因作用的研究

发布时间：2017-03-28 08:12

  本文关键词：转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来，随着医疗水平的不断提高，移植技术已成为治疗疾病的重要手段，但由移植物所引起的移植排斥现象的出现成为阻碍移植技术成功的重要因素，因此，阻止移植排斥现象的出现保证移植技术成功就成为当今医学在移植技术领域迫在眉睫的任务。 转录因子Foxp3（Forkhead box protein3）特异性的表达在调节性T细胞（RegulatoryT cells,Tregs）上，并且它在Tregs的分化、发育和维持抑制功能方面起着关键性作用。而在移植耐受模型体内Tregs抑制了效应细胞的活化并且控制效应细胞对移植物的应答，目前，Tregs被认为是在实体器官移植治疗方面一种有潜力的治疗手段。Tregs在移植物的同种异体应答的不同阶段发挥它们的调节功能，体内和体外实验对Tregs增殖的研究进展为Tregs在移植物治疗方面提供了新的进展。 MDSC（myeloid-derived suppressor cell）是一类异质细胞群，它是由巨噬细胞、粒细胞以及处于不同成熟阶段的树突状细胞组成。已有研究证实在移植排斥中，MDSC拥有与Tregs细胞相似的角色。MDSC可以抑制效应T细胞的增殖同时可以通过iNOS依赖的方式来诱导接触依赖性的细胞凋亡。iNOS抑制剂可以诱导对耐受移植物的排斥，从而证实了iNOS在MDSC抑制功能中的重要作用。同样有研究证实骨髓来源的MDSC可以通过Arg1依赖途径抑制移植物抗宿主疾病的发生，从而证实MDSC在移植排斥中发挥重要作用。 基于上述背景，我们设想将转录因子Foxp3转染到小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞后，可使RAW264.7细胞通过模拟Tregs和MDSC的作用，参与免疫反应的负性调节，从而为移植排斥的治疗提供新的细胞治疗措施。为此，本研究从以下三个方面展开：1.稳定表达Foxp3的巨噬细胞RAW264.7模型的建立 首先构建真核表达载体pIRES2-EGFP/mFoxp3，经过转染、筛选及鉴定，得到了稳定表达GFP-Foxp3蛋白的RAW264.7细胞（F7-1-14）以及稳定表达GFP蛋白的RAW264.7细胞（IRES2），为接下来的实验奠定基础。2．过表达Foxp3的RAW264.7细胞表面标志（CTLA-4、GITR及GITRL）的变化 为了探讨将Foxp3基因转染到巨噬细胞系RAW264.7细胞后，RAW264.7细胞中与Tregs的免疫抑制功能相关分子CTLA-4及GITR的表达变化，我们采用半定量RT-PCR的方法检测F7-1-14细胞、IRES2细胞及RAW264.7细胞CTLA-4及GITR的mRNA的表达情况，结果显示，与IRES2细胞及RAW264.7细胞相比，， F7-1-14细胞CTLA-4及GITR的mRNA表达水平明显增加。结果说明Foxp3能够促进巨噬细胞系RAW264.7细胞中与Tregs的免疫抑制功能相关的表面分子CTLA-4及GITR的表达，从而参与免疫反应的负性调节。在此过程中，我们还发现F7-1-14细胞的GITRL的mRNA表达水平比IRES2细胞及RAW264.7细胞明显升高。我们推测转染Foxp3的RAW264.7细胞表面的GITRL分子可以与Tregs细胞表面的GITR分子结合，通过激活下游的通路达到促进Tregs的增殖能力，从而进一步维持免疫调节和机体耐受。由此我们推测，将小鼠的转录因子Foxp3转染到RAW264.7细胞后，此细胞可能通过模拟Tregs的功能作用，从而参与免疫反应的负性调节。3．过表达Foxp3的RAW264.7细胞免疫抑制相关基因（iNOS、Arg1）表达的变化 为了探讨将Foxp3基因转染到巨噬细胞系RAW264.7细胞后，是否影响RAW264.7细胞中与MDSC的免疫抑制功能相关分子iNOS及Arg1的表达，我们采用实时定量PCR的方法检测了F7-1-14细胞、IRES2细胞及RAW264.7细胞中iNOS及Arg1的表达情况，结果显示，与IRES2细胞及RAW264.7细胞相比，F7-1-14细胞中iNOS及Arg1的mRNA表达水平明显增加。这说明Foxp3能够增强巨噬细胞系RAW264.7细胞中免疫抑制功能相关分子iNOS和Arg1的mRNA表达，通过iNOS依赖的方式诱导接触依赖性的细胞凋亡及Arg1依赖途径，从而抑制移植物抗宿主疾病的发生。由此我们推测，将小鼠的转录因子Foxp3转染到RAW264.7细胞后，此细胞可能通过模拟MDSC的功能作用，从而发挥抑制移植物抗宿主疾病的发生。 本研究意义在于使巨噬细胞拥有免疫抑制的能力，从而为移植排斥的治疗提供了新的细胞治疗措施。
【关键词】：Foxp3 Tregs MDSC 巨噬细胞 移植排斥
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 提要4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 英文缩写词14-15
• 引言15-17
• 文献综述17-29
• 一、Foxp3 的研究进展17-21
• 1、Foxp3 的结构17
• 2、Foxp3 与 Tregs17-19
• 3、Tregs 与移植排斥的关系19-21
• 二、MDSC 的研究进展21-29
• 1、MDSC 的组成21-23
• 2、MDSC 的免疫抑制机制23-26
• 3、MDSC 与移植排斥的关系26-29
• 课题设计思路及实验方案29-31
• 实验研究31-58
• 一、材料31-35
• 1. 细胞株31
• 2. 质粒和菌株31
• 3. 实验试剂31-32
• 4. 实验仪器32-33
• 5. 主要试剂的配制33-35
• 二、方法35-43
• 1. RAW264.7 细胞的培养35
• 2. 逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）35-37
• 3. 真核表达质粒 pIRES2-EGFP/mFoxp3 的构建37-39
• 4. 真核表达质粒的转染与稳定表达细胞系的筛选39-40
• 5. 流式细胞术（Flow cytometry, FCM）40-41
• 6. RT-PCR 检测41-42
• 7. 实时定量 PCR 检测42
• 8. 结果统计分析42-43
• 三、实验结果43-54
• 1. 建立稳定表达 Foxp3 的 RAW264.7 细胞系43-49
• 2. 过表达 Foxp3 的 RAW264.7 细胞表面标志的变化49-53
• 3. 过表达 Foxp3 的 RAW264.7 细胞免疫抑制相关基因表达的变化53-54
• 四、讨论54-57
• 五、结论57
• 六、有待于进一步研究的工作57-58
• 参考文献58-66
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果66-67
• 致谢67

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本文编号：271927