慢性生长激素对肝脏STAT5信号的调节作用

发布时间：2017-03-28 10:11

  本文关键词：慢性生长激素对肝脏STAT5信号的调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 生长激素(growth hormone, GH)是人体一种重要的激素,在出生后的生长、代谢、老化及肿瘤的形成过程中发生重要作用。 GH已经广泛地应用于临床治疗。最初,GH主要应用于GH缺乏症的治疗,后来逐渐推广到其它疾病的治疗,例如,肠外瘘、肝硬化门脉高压、急性坏死性胰腺炎、重症感染、扩张性心肌病、呼吸功能衰竭、慢性肾病等等。随着应用范围的扩大,GH的疗效及可能的副作用得到了越来越多的关注,包括生长激素激素抵抗、白血病、肿瘤等。为了更好地了解临床副作用的机制,必然要深入到分子层面的研究。 GH在体内最重要的靶器官是肝脏。GH通过janus酪氨酸蛋白激酶2(anus tyrosine protein kinase2, JAK2)/信号激活下游信号通路。转录因子STAT5(Signal transducer and activators of transcription5)是GH在体内调节代谢作用的主要效应因子。正常情况下,GH与GHR结合,JAK2可与GHR的胞内段结合而发生自身磷酸化,然后磷酸化GHR,形成GH-GHR-JAK2的多聚体结合,为STAT5提供对接位点,STAT5磷酸化后,形成二聚体,转移入细胞核内,与靶基因转录因子结合位点结合,调节基因的转录。而对GH-JAK2/STAT5信号通路负调解机制的研究目前多集中于GHR水平,及细胞因子抑制物(Suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族以及调节因子蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(Src homology2domain containing phosphotyrosine phosphatase2, SHP2)。 SHP2对生长激素的调节研究报道很少,有个别报道认为SHP2可和生长激素受体结合。但SHP2可和生长激素受体结合的生理病理意义还不清楚。为了更好地了解慢性GH治疗对机体可能产生的副作用及机制,本研究采用HepG2细胞实验及正常的幼年BALB/c小鼠,是许多其它已经发表的不同模型研究的一个补充。 目的 本课题通过体内外实验研究急慢性生长激素刺激对STAT5信号的调节作用,探索GH抵抗的分子机制,及SHP2可能的作用。 方法 一、细胞实验部分 1、常规培养HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中,细胞传代均匀铺4个孔,把4孔分为2组Control组和急性GH刺激组,每组2孔,待细胞长至约90%后,予血清饥饿12小时,裂解细胞前20分钟予以急性GH刺激组GH刺激(GH浓度储存浓度为1.33mg/ml,工作浓度为2000ng/ml,用无血清DMEM液稀释),予以对照组等体积的无血清DMEM培养液,裂解细胞提取总蛋白,Western blot蛋白分析法检测p-STAT5、STAT5蛋白表达水平。 2、常规培养HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中,细胞传代均匀铺4个孔,把4孔分为2组Control组和慢性GH刺激组,每组2孔,待细胞长至约90%后,予血清饥饿12小时,裂解细胞前6小时慢性GH刺激组予以GH刺激,予以对照组等体积无血清DMEM培养液,至裂解前20分钟实验组及对照组均予以GH刺激,裂解细胞提取总蛋白,Western blot蛋白分析法检测p-STAT5、STAT5蛋白表达水平。 3、常规培养的HepG2细胞传代均匀铺2个60mm细胞培养皿,随机分为GH刺激组和Control组,待细胞长至约90%后,予血清饥饿12小时,裂解细胞前6小时实验组予以GH刺激,对照组予以等体积的无血清DMEM培养液,裂解细胞,提取总蛋白。免疫共沉淀分析法(CO-IP)检测胞质内与CIS结合的GHR的表达水平。 4、统计分析：所有结果经Excel2010及SPSS13.0统计软件分析,数据以“算术平均值±标准差(：arithmetic mean±standard deviation,M±SD)"表示。两组间比较若方差齐采用两独立样本t检验(Independent-Samples T Test),若方差不齐则采用Satterthwaite近似r检验,以P0.05视为有显著性差异。 二、动物实验部分 1、实验设计：6-8周正常幼年BALB/c小鼠32只,随机编号为1-32,测量空腹体重。随机分为两组：对照组和慢性GH组,每组16只,对照组每天注射0.2ml PBS,'慢性GH组每天按1μg/g体重剂量(溶于0.2ml PBS)腹腔注射rhGH,给药3周。完成3周慢性生长激素刺激后,临处死前一天晚上23：00饥饿小鼠,并保证饮水充足。处死前凌晨8点,把对照组和慢性GH组分别随机分成非急性GH组(PBS+PBS组、慢性GH+PBS组)和急性GH组(PBS+急性GH组、慢性GH+急性GH组)。非急性GH组临处死前20分钟予腹腔注射PBS0.2ml,急性GH组予以腹腔注射生长激素一次(1μg/g)。操作时对照组和慢性GH两组交替进行,先处理非急性生长激素组后处理急性生长激素组。处死前使用麻醉剂苯巴比妥充分麻醉后,快速摘取肝脏置入液氮中速冻,再移至-80℃冰箱长期保存备用。 2、比较慢性GH和对照组两组各16只小鼠体重增长情况。 3、比较对照组和慢性GH组肝内基础STAT5及p-STAT5水平。低温研磨非急性GH组(即PBS+PBS组、慢性GH+PBS组)肝脏绿豆大小组织,提取蛋白,western blot检测STAT5及p-STAT5水平。 4、检测急性GH刺激对慢性GH组STAT5磷酸化水平的影响。低温研磨慢性GH组(包括慢性GH+PBS组,慢性GH+急性GH组)肝脏绿豆大小组织,提取蛋白,western blot检测STAT5及p-STAT5水平。 5、比较对照组及慢性GH组中急性GH刺激后的肝内STAT5及p-STAT5水平。低温研磨急性GH组(包括PBS+急性GH组,慢性GH+急性GH组)肝脏绿豆大小组织,提取蛋白,western blot检测STAT5及p-STAT5水平。 6、在无急性GH刺激时,比较对照组及慢性GH组GHR及SHP2表达。低温研磨非急性GH组(包括PBS+PBS组、慢性GH+PBS组)肝脏绿豆大小组织,提取蛋白,western blot检测GHR及SHP2水平。 7、比较对照组及慢性GH组在无急性GH刺激时GHR与SHP2相互结合的情况。低温研磨非急性GH组(包括PBS+PBS组、慢性GH+PBS组)肝脏绿豆大小组织,按CO-IP步骤提取蛋白,以针对SHP2的蛋白沉淀肝脏SHP2蛋白,然后以western blot检测沉淀蛋白中的GHR水平。 8、统计分析：所有结果经Exce12010及SPSS13.0统计软件分析,数据以“算术平均值±标准差(arithmetic mean±standard deviation,M±SD)”表示。两组间比较若方差齐则采用两独立样本t检验(Independent-Samples T Test),方差不齐则采用Satterthwaite近似t检验。P-STAT5、STAT5蛋白表达水平的比较采用t检验,经Bonferroni校正以P0.017视为有显著性差异。GHR与SHP2的测定为两组间比较采用两独立样本t检验,以P值0.05视为有显著性差异。 结果 一、细胞实验结果 1、Western blot检测结果显示急性GH刺激组较Control组p-STAT5蛋白表达水平显著提高(t=-22.649,P=0.000),Western blot以GAPDH作内参,两组灰度比值比分别为0.513±0.052及0.029±0.008,STAT5蛋白无显著差异,两组灰度值比值为1.225±0.088及1.146±0.102忙-1.473,P=0.181)。 2、在予以6个小时慢性刺激的慢性GH刺激组,以及予以等体积DMEM对照的Control组,临裂解前20分钟全部予以20分钟急性GH刺激,慢性GH刺激组较Control组p-STAT5水平显著降低(灰度比值比分别为0.237±0.043和0.959±0.298,t=5.868,P=0.000),而STAT5水平未见显著差异,两组灰度值比分别为0.875±0.086及0.788±0.079(t=-1.824,P=0.098),Western blot以GAPDH作内参。 3、CO-IP结果显示,慢性GH刺激组与Control组相比,与胞浆内CIS结合的GHR蛋白表达水平显著升高(t=14.016,P,=0.000),两组灰度值比值分别为1.896±0.193及0.222±0.075。 二、动物实验结果 1、慢性GH刺激导致小鼠体重增加,慢性GH组和对照组的小鼠相比,慢性GH组小鼠平均增加体重比PBS对照组小鼠重1.278g(t=-3.667,P=0.001)。两组灰度值比值分别为3.883±0.962及2.605±1.008。 2、慢性GH+PBS组小鼠肝脏细胞基础的p-STAT5水平(0.367±0.124)显著低于PBS+PBS组(1.058±0.091)(t=12.272,P=0.000)；但肝脏内总STAT5蛋白水平无显著差异,灰度值比值为0.741±0.157及0.799±0.086(t=0.927,P=0.370),Western blot以β-Actin作为内参。 3、在慢性GH组中,与处死前予PBS处理的小鼠相比,急性GH可使小鼠肝脏细胞p-STAT5水平显著升高(0.005±0.001vs0.214±0.027,t=-21.544,P=0.000),而STAT5水平无显著差异(t=-0.251,P=0.805),两组灰度值比值为0.625±0.046和0.632±0.060,Western blot以β-Actin作为内参。 4、急性生长激素可使对照组及慢性GH组STAT5磷酸化,但慢性GH组的P-STAT5水平远低于PBS对照组(0.418±0.091vs0.677±0.080,t=6.036,P=0.000), STAT5水平无显著差异(0.826±0.093vs0.811±0.073,t=-0.360,P=0.724)Western blot以P-Actin作为内参。 5、在无急性GH刺激时,对照组与慢性GH组相比,总GHR蛋白的表达无显著差异,灰度值比值分别为1.280±0.297及1.178±0.368(t=0.611,P=0.551)。总SHP2亦无显著差异,灰度值比值为1.297±0.287及1.400±0.272(t=-0.741,P=0.471), Western blot以GAPDH作为内参。 6、免疫共沉淀结果显示,在无急性GH刺激时,慢性GH组内与SHP2结合的GHR量较对照组高,两组灰度比值比分别为0.537±0.090和0.282±0.113(t=-4.980,P=0.000)。 结论 在HepG2细胞内,慢性GH刺激导致STAT5对外源性GH的抵抗,其机制可能是GHR与胞浆内CIS的结合增加。在小鼠体内,慢性GH刺激导致肝脏P-STAT5的抑制,相应的,GHR与SHP2的结合也增加。因此,本研究认为慢性GH刺激导致的GH抵抗的机制是GHR与SHP2的结合活性的增加。本研究结论的提出是文献报道中根据细胞培养研究提出的GHR和SHP2结合可能抑制生长激素信号的假设的一个实例。
【关键词】：生长激素 STAT5 HepG2 肝脏 GHR CIS SHP2
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R335
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 第一章 前言16-20
• 第二章 材料与方法20-41
• 一、体外实验部分20-29
• 二、体内实验部分29-41
• 第三章 结果41-60
• 一、体外实验结果41-47
• 二、体内实验结果47-60
• 第四章 讨论60-63
• 全文小结63-64
• 参考文献64-71
• 中英文缩略词对照表71-72
• 在读期间已经发表和将要发表的论文72-73
• 致谢73-74

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