稳定表达牛胰蛋白酶的MDCK细胞的构建及对流感病毒增殖影响的研究

发布时间：2017-03-29 09:05

  本文关键词：稳定表达牛胰蛋白酶的MDCK细胞的构建及对流感病毒增殖影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流感疫苗是目前预防流感发生和传播最为有效的手段。传统的鸡胚生产流感疫苗系统存在些不足之处，比如培养的流感病毒易发生抗原变异，与人群流行株不能完全匹配；残留卵清蛋白易引起过敏反应；尤其当出现大流行时健康鸡胚供应受限不能满足短时间内对疫苗的大量需求。而哺乳动物细胞培养系统能够避免这些问题，成为未来疫苗生产的发展趋势。临床试验表明使用MDCK等细胞生产的流感疫苗是安全的并有高免疫原性，然而较低的病毒滴度是其大规模生产的瓶颈之。流感病毒血凝素HA被宿主蛋白酶裂解为成熟的HA1和HA2，才能够介导病毒囊膜与靶细胞膜融合，起始病毒生命周期，因此HA的裂解是病毒感染细胞的首要前提，而MDCK细胞本身并不具备裂解HA的蛋白酶类，成为产量提升的限制因素。研究证明外加胰蛋白酶能够有效地提高病毒产量，本研究采取基因工程手段将胰蛋白酶基因导入MDCK细胞，构建能够自主表达裂解病毒的蛋白酶的细胞系，用于疫苗规模化生产，简化生产工艺或更加有效地使疫苗产量提升。 胰蛋白酶本身存在酶原和酶两种形式，而自然状态人呼吸道上皮细胞中，蛋白酶裂解HA可能发生在胞外、胞内或与胞膜相关，为此我们构建了酶原和酶两种形式，分泌、胞内、跨膜3种细胞分布的共6种真核表达载体。基因合成了完整的牛胰蛋白酶表达序列，设计引物去除N端分泌信号肽或酶原激活肽的核苷酸序列，PCR扩增并克隆了分泌型酶原和酶、胞内型酶原和酶的表达序列；借鉴跨膜丝氨酸蛋白酶HAT基因的跨膜区TM，设计引物使TM和胰酶基因各有部分序列重叠，采用重叠PCR扩增克隆出跨膜型酶原和酶的目的基因。6条目的序列引入Kozak序列和NheI和EcoRI酶切位点，保持正确的开放阅读框，双酶切连接至pcDNA3.1真核表达载体，从而构建了3种细胞分布2种酶型的真核重组表达质粒。 大量提取无内毒素高纯度的表达质粒，经脂质体转染MDCK细胞，建立了目的基因的瞬时表达体系。免疫印迹实验证明载体成功表达且表达蛋白大小符合预期，分别为分泌酶原24.3kD、分泌酶23.4kD、胞内酶原24.3kD、胞内酶23.4kD、跨膜酶原30.2kD、跨膜酶29.2kD。间接免疫荧光实验显示表达亚细胞分布正确。以特异荧光底物法检测各型表达蛋白酶活性发现分泌型酶原的活性最高，转染该质粒的MDCK培养甲型流感疫苗株培养72h病毒的产量的增加有统计意义，从而筛选出分泌酶原为重组细胞活化病毒的最佳表达作用模式。 利用G418抗性筛选和有限稀释法克隆，通过PCR、RT-PCR及间接免疫荧光鉴定，获得了稳定表达分泌型牛胰蛋白酶原的细胞株命名为MT21。将该单克隆细胞连续传代15代次后仍可保持完整的外源基因，检测连续传代细胞表达上清胰酶活性没有统计差异，目的蛋白表达稳定。 将单克隆细胞MT21与正常MDCK细胞分别在有无外加低浓度（0.5μg/ml）TPCK-trypsin条件下，以0.001的感染复数接种野生H1N1、H3N2、B型流感病毒株及甲流疫苗株，收集无血清37℃培养24h、48h、72h的病毒测定NA活性、绘制病毒生长曲线，检测72h各病毒CCID50滴度，结果所有测试的毒株在MT21细胞上滴度高于在正常MDCK细胞上测定的结果，外加胰酶后差异更显著，说明我们构建的MDCK-S.pro-try细胞系因分泌表达胰蛋白酶原而比MDCK细胞更适于流感病毒的增殖，不仅可以应用至细胞流感疫苗的大规模生产，同时也为实验室有效分离培养和监测流感病毒、致病机制研究、抗流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定等提供了重要的研究工具。
【关键词】：人流感病毒 细胞流感疫苗 HA裂解 胰蛋白酶 MDCK细胞 G418筛选
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 实验流程及技术路线13-14
• 第一部分 重组牛胰酶基因真核表达载体的构建及瞬时转染 MDCK细胞的功能研究14-38
• 引言14-15
• 一、实验材料15-16
• 二、实验方法16-27
• 三、结果27-33
• 1. 目的基因的克隆27-28
• 2. 重组表达载体的鉴定28-29
• 3. 瞬时转染 MDCK 细胞的表达鉴定29-31
• 4. 瞬时转染表达目的蛋白酶活性检测31-33
• 四、讨论33-37
• 五、小结37-38
• 第二部分 稳定表达分泌型胰酶原 MDCK 单克隆细胞的筛选及鉴定38-50
• 引言38
• 一、实验材料38-39
• 二、实验方法39-42
• 三、结果42-47
• 1. 筛选培养基中 G418 浓度的选择42-43
• 2. 有限稀释法筛选单克隆细胞43
• 3. MT21 基因组的 PCR 和 RT-PCR 鉴定43-44
• 4. MT21 细胞株目的蛋白的表达鉴定44-45
• 5. 连续传代单克隆株基因组的 PCR 和 RT-PCR 鉴定45-46
• 6. 连续传代单克隆细胞表达目的蛋白的酶活性检测46-47
• 四、讨论47-49
• 五、小结49-50
• 第三部分 流感病毒在稳定表达胰酶原的 MDCK 细胞上的增殖特性研究50-63
• 引言50
• 一、实验材料50-51
• 二、实验方法51-54
• 三、结果54-59
• 1. 接种毒株 CCID_50滴度检测54
• 2. 不同病毒株的细胞培养54-59
• 2.1 野毒株 A/天津津南/15/2009(H1N1)55-56
• 2.2 野毒株 A/福建同安/196/2009(H3N2)56-57
• 2.3 野毒株 B/黑龙江呼兰/116/20105357-58
• 2.4 疫苗株 A/California/2009(H1N1)58-59
• 3. Western blot 鉴定不同细胞中 HA 的裂解情况59
• 四、讨论59-62
• 五、小结62-63
• 全文总结63
• 后续需解决的问题及工作计划63-64
• 参考文献64-70
• 综述：流感病毒血凝素蛋白裂解机制的研究进展70-76
• 参考文献74-76
• 缩略语表76-78
• 附录一 测序比对结果78-81
• 附录二 pcDNA3.1 载体图谱81-82
• 致谢82-83

【共引文献】

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本文编号：274089