Notch信号对骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化的研究

发布时间：2017-04-02 05:15

  本文关键词：Notch信号对骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）属于成体干细胞，具有自我更新和多项分化潜能，已成为骨疾病治疗及组织工程中的研究热点。骨形态发生蛋白9（bonemorphogenetic protein9，BMP9）是目前认为BMPs家族诱导成骨能力最强的一种，但是对其诱导成骨分化的分子机制不甚清楚。Notch信号通路是生物体内一较保守的信号通路，在生物体胚胎期及出生后发育过程中发挥着重要的功能，调控着多种细胞的增殖和分化。同时，也有多项研究指出Notch信号通路参与了间充干（mesenchymal stemcells，MSCs）的成骨分化过程，对于骨骼系统的发育有着不可或缺的作用。课题组前期研究结果表明，Notch信号通路能够协同BMP9促MSCs成骨分化。本研究通过dnNotch1下调Notch信号通路，进一步明确Notch信号对BMP9诱导的MSCs成骨分化影响（第一部分）；构建能特异阻滞整个经典Notch信号的关键转录因子Rbpj干扰腺病毒，拟进一步确定其促进成骨分化的作用和机制（第二部分）；由于重组腺病毒效果不稳定，考虑可能有miRNA干扰，故通过生物信息学和细胞实验探讨Notch相关miRNA mir133在BMP9诱导MSCs成骨分化的作用进行了初步探讨（第三部分）。 第一部分 Notch1信号对骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化的研究 目的：研究dnNotch1下调Notch后，，对骨形态发生蛋白9诱导的MSCs成骨分化的影响及可能机制。方法：利用显性负性Notch1受体腺病毒载体（AdRdnNotch1）处理MEF细胞，采用活性测定、细胞化学染色分析早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的变化； RT-PCR检测晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）的表达和下游靶基因的表达情况；Western和荧光素酶分别检测BMP9经典信号通路活化标志p-Smad1/5/8蛋白和Smad结合元件（Smad-binding element，SBE）活性；结晶紫染色、流式细胞术分析其对细胞周期及凋亡影响；RT-PCR检测BMP9下游靶基因的表达情况。结果：与对照组相比，AdRdnNotch1处理MEF后，与对照组相比，其3、5、7d后，ALP活性均有所降低（P＜0.05），并与AdRdnNotch1呈剂量依赖性；11d OPN和OCN表达量也有所下调（P＜0.05）；BMP9下游靶基因表达也受到了一定的抑制。同时发现，BMPs经典通路中Smad1/5/8总蛋白量没有明显变化，而p-Smad1/5/8蛋白表达水平及SBE活性也受到了一定的抑制（P＜0.05）；结晶紫及流式分析提示AdRdnNotch1能够抑制BMP9诱导的早期细胞增殖，但不影响细胞凋亡。结论：AdRdnNotch1竞争抑制Notch1信号后，BMP9诱导MEF的成骨能力显著下降，其可能是通过抑制MSCs早期增殖和BMP信号通路的活化两方面来抑制BMP9诱导的成骨分化进程，进一步提示Notch在BMP9诱导的MSCs成骨过程中发挥着重要的协同作用。 第二部分 携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及功能鉴定 目的：构建能特异性干扰小鼠Rbpj基因的重组腺病毒AdsiRbpj，为进一步研究Notch在骨发育和重建中的作用及其相关分子机制提供有用且实用的技术手段。方法：设计3对针对小鼠Rbpj基因的siRNA序列，将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒，再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒，经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒，构建好的AdsiRbpj与BMP9共处理骨髓间充质干细胞C3H10T1/2，利用RT-PCR、Western blot、组织化学和RT-qPCR进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。结果：初步筛选出干扰效果较好的AdsiRbpj-3，但是干扰效果不稳定。结论：AdsiRbpj构建未达到预期目的，考虑是否有受到miRNA等小RNA的干扰。 第三部分 Notch相关miRNA在BMP9诱导的MSCs成骨分化作用的初步探讨 目的：探讨Notch相关miRNA在BMP9诱导的MSCs成骨分化的作用。方法：在线软件预测分析与Rbpj基因相关miRNA，qPCR检测BMP9诱导MSCs（C3H10T1/2）成骨分化后Rbpj相关miRNA表达变化情况。结果：多个软件提示可能与Rbpj基因结合的miRNA有mir133a、mir133b及mir21。qPCR证实BMP9能够上调C3H10T1/2中mir133a、mir133b的表达量，下调mir21的表达量。在进一步生物信息学分析发现， Notch信号通路中的共激活因子中的MAML1,3、共抑制因子中CTBP2和转录因子RBPJ基因上都有mir133作用位点。结论：mir133极有可能调控了Notch信号通路，但需要进一步实验证实。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 Notch1 骨形态发生蛋白9 Rbpj 成骨
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-20
• 参考文献17-20
• 第一部分 Notch1 信号对骨形态发生蛋白 9 诱导的间充质干细胞成骨分化的研究20-44
• 1 材料与方法21-30
• 2 结果30-39
• 3 讨论39-40
• 参考文献40-44
• 第二部分 携带 siRbpj 重组腺病毒载体的构建及功能鉴定44-61
• 1 材料与方法44-50
• 2 结果50-57
• 3 讨论57-58
• 参考文献58-61
• 第三部分 初步探讨 Notch 相关 microRNA 在 BMP9 诱导的 MSCs 成骨分化的作用61-70
• 1 材料与方法62-63
• 2 结果63-67
• 3 讨论67-68
• 参考文献68-70
• 全文总结70-71
• 文献综述71-78
• 参考文献74-78
• 致谢78-79
• 硕士在读期间发表论文题录79-80

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