cAMP受体蛋白CRP对霍乱弧菌和河弧菌自然感受态调控机制的研究

发布时间：2017-04-02 05:01

  本文关键词：cAMP受体蛋白CRP对霍乱弧菌和河弧菌自然感受态调控机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在自然条件下,细菌主动摄取外源DNA,通过同源重组整合入染色体稳定遗传的过程被称作自然转化(natural transformation)。自然转化是细菌中基因水平转移的重要策略之一。通过自然转化,细菌能够获得新的性状以适应外界不同的环境。大量的研究表明自然转化现象在弧菌科细菌中普遍存在,在弧菌的遗传多样性和进化中具有重要的作用。发生自然转化的前提条件是细菌须处于自然感受状态(natural competence)。 TfoX(也称SXY),是霍乱弧菌(V. cholerae)重要的感受态调节子,其编码基因是VC1153,在几丁质存在时,它可诱导感受态相关基因pilQ、pilA、comEA和ComEC的表达,对外源DNA的摄取和运输发挥着重要的作用。cAMP受体蛋白CRP (cAMP receptor protein, CRP)是细菌中重要的全局性调节子,对霍乱弧菌自然感受态形成也发挥重要的调节作用,能促进pilA、comEA和chiA-1的表达,但是具体机制仍不清楚。在本研究中,我们以霍乱弧菌和河弧菌(V.fluvialis)这两种重要的致病性弧菌为模式菌,进一步探索CRP对弧菌自然感受态的调控作用。基于文献中已确定的霍乱弧菌TfoXVC启动子区调控序列,我们通过软件Virtual Foot print和Regulatory Sequence Analysis Tools (RSAT)预测到其启动子区存在可能的CRP的结合位点。通过比较霍乱弧菌野生株和CRP缺失株遗传背景下mRNA水平、tfoXVC-lacZ启动子报告基因活性说明CRP转录水平调控感受态调节子TfoXVC,通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)进一步证明cAMP-CRP复合物直接结合于tfoXVC启动区调控tfoXVC的转录,进而促进细胞感受态的形成。自然转化表型实验表明,霍乱弧菌ACRP、ΔTfoX的转化频率都较野生株明显降低;与此相一致,与野生株相比ACRP、Δ1153、 ACRPΔ1153中感受态相关基因chiA-1、comEA、pilB、pilM mRNA的表达水平都呈下调趋势。为进一步证明cAMP-CRP复合物转录水平调节TfoX的保守性,我们在新发食源性致病菌河弧菌中进行了验证。序列比对表明,河弧菌的TfoXVF与霍乱弧菌的TfoXVC在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为75.21%和80.69%。首先我们利用5'RACE (rapid-amplification of cDNA ends)确定了河弧菌tfoXVF mRNA的转录起始位点(transcription start site, TSS)位于tfoXVF ORF上游106bp处,据TSS推测的启动子-10区、-35区和SD序列分别为TATGAT、TCCGGA和GGGA。启动子区序列分析也表明存在可能的CRP结合位点。tfoXVF mRNA水平和tfoXVF -lux启动子报告基因活性检测及凝胶迁移实验证实同霍乱弧菌一样,河弧菌中cAMP-CRP复合体直接结合于tfoXVF启动区调控其转录。进一步的序列比对和生物信息分析表明这种调控机制在包括创伤弧菌、弗尼斯弧菌、鳗弧菌等在内的弧菌属中是保守的,其TfoX同源基因上游都存在cAMP-CRP复合体的结合位点。此外,本研究初步探索了霍乱弧菌VC1152的功能,VC1152与TfoXVC编码基因VC1153的转录方向相反,共用染色体上的基因间隔区序列／启动子,存在CRP的结合位点。结构域分析表明VC1152含有HD-domain/PDEase-1, HD-domain是一保守的蛋白结构域,存在于具有磷酸水解酶活性的蛋白酶超家族中,这些蛋白可能参与细菌核酸代谢、信号转导或其他的功能调节等。本研究中我们探索了VC1152参与自然感受态的可能性和与CRP的调控关系。首先,我们利用5' RACE确定了霍乱弧菌VC1152 mRNA的转录起始位点位于VC1152 ORF上游8bp处,启动子报告基因活性分析及VC1152转录水平分析表明CRP对VC1152有正向调节作用。自然转化实验中,霍乱弧菌△1152的转化频率比野生株明显降低。感受态相关基因转录水平分析显示,△1152中chiA-1、comEA、pilB、pilM mRNA的转录水平与野生株相比呈下调趋势。我们的结果初步提示VC1152可能参与霍乱弧菌自然感受态的形成,具体机制仍有待进一步研究验证。
【关键词】：霍乱弧菌 河弧菌 自然感受态 cAMP受体蛋白(CRP) TfoX
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.3
【目录】：

• 缩略词4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-15
• 第一部分 cAMP-CRP复合体启动子水平调节tfoX15-42
• (一) 霍乱弧菌/河弧菌WT和△CRP中TfoX启动子活性分析15-28
• 一. 材料与方法15-23
• 1. 材料15-17
• 2. 实验方法17-23
• 二. 结果23-28
• (二) cAMP-CRP复合物直接结合霍乱弧菌/河弧菌tfoX启动子区28-33
• 1. 材料与方法28-31
• 2. 结果31-33
• (三) 霍乱弧菌和河弧菌的自然转化实验33-42
• 1. 材料与方法33-39
• 2. 结果39-42
• 第二部分 霍乱弧菌VC1152基因功能探索42-48
• 一. 材料与方法42-43
• 二. 结果43-48
• 讨论48-51
• 小结51-52
• 参考文献52-55
• 综述55-63
• 参考文献59-63
• 硕士研究生期间发表的论文63-64
• 致谢64

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本文编号：281884