金属标记结合生物质谱的蛋白质组相对定量及绝对定量新方法研究

发布时间：2017-04-02 22:08

  本文关键词：金属标记结合生物质谱的蛋白质组相对定量及绝对定量新方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着蛋白质组学研究的深入，蛋白质组学已经进入大规模定量的时代。但是目前蛋白质的定量方法仍然不够完善，发展规模化、准确度高的定量方法仍然是定量蛋白质组学的最大挑战。金属标记结合质谱的定量方法由于标记效率高、定量准确度高、价格低廉等优势引起了广泛的关注。 本论文基于金属元素标记技术，发展了金属元素标记结合质谱用于蛋白质N-末端肽的鉴定及相对定量新方法和18O/金属等重标记结合质谱蛋白质组绝对定量新方法，使金属元素标记方法在定量蛋白质组学研究中进一步深入。 本论文由三章组成。在第一章，介绍了目前定量蛋白质组学的研究现状、稳定同位素标记和金属元素标记方法在定量蛋白质组学中应用；还介绍了基于质谱技术的蛋白质N-末端肽鉴定及相对定量和双重等重标记的蛋白质组定量技术的最新进展，最后提出本论文研究的内容。 在第二章，介绍了金属元素标记结合质谱用于蛋白质N-末端肽的鉴定及相对定量新方法。通过DOTA-NHS-ester双功能试剂与蛋白质N-末端肽反应，并与镧系金属盐离子螯合形成标签，建立了一种基于生物质谱的蛋白质N-末端肽鉴定及相对定量新方法。实验结果表明，金属元素能够在蛋白质水平使N-末端肽完全标记，此后通过异硫氰酸脂修饰的硅球选择性去除酶切后新生肽段，实现了对N-末端肽富集。将该方法应用于在55C和75C温度培养的腾冲嗜热菌中蛋白质组N-末端肽的分析，成功地鉴定到158种蛋白质的N-末端肽，其中24种蛋白质的N-末端肽存在着部分乙酰化修饰。另外，大分子的金属标签能够使小于6个氨基酸的短序列N-末端肽获得鉴定，其中短序列的N-末端肽占总鉴定的N-末端肽的55%。最后，发展了基于N-末段肽相对定量方法，以溶菌酶及核糖核酸酶B模式蛋白，在两个数量级内其标准曲线的相关系数（R2）分别为0.9994和0.9997，相对标准偏差RSD值均小于5%。在不同温度培养腾冲嗜热菌中，80个蛋白质具有定量信息，与55C培养腾冲嗜热菌中蛋白质量比较，在75C培养的腾冲嗜热菌中，7个蛋白质表达量上调，，16个蛋白质表达量下调，并且大部分丰度变化大的蛋白质都参与了蛋白质的合成过程。 在第三章，介绍了18O/金属等重标记结合质谱蛋白质组绝对定量新方法。通过金属标记肽段的N-末端和18O标记肽段的C-端，实现双重等重标记，并且首次将双重等重标记与多反应监测技术相结合用于目标蛋白质的绝对定量。实验结果表明：18O+Ho与Tm都能对肽段实现高效的标记并且7天内保持稳定，满足了标记定量的要求；两种标记的肽段在色谱中的保留时间完全一致，保证了同时在质谱碰撞池碎裂和质谱分析；18O+Ho与Tm标记的肽段等量混合，经二级碎裂后b、y以相差4Da离子1:1成对出现，说明定量的准确性高；最后在腾冲嗜热菌全蛋白酶切肽段的基质干扰下，MRM质谱分析目标肽段的b离子和y离子的母子离子对在两个数量级动态范围内线性相关系数R2均为0.999，定量限为0.7fmol/μL且RSD＜10%，相对误差小于10%(除接近定量限的结果外)，表明该方法可以准确地用于目标蛋白质的绝对定量分析。
【关键词】：定量蛋白质组学 生物质谱 金属标记 18O标记
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 前言12-20
• 1.1 定量蛋白质组学12
• 1.2 稳定同位数标记在定量蛋白质组学中的应用12-14
• 1.3 金属元素标记在定量蛋白质组学中的应用14-15
• 1.4 基于质谱技术的蛋白质 N-末端肽的鉴定及相对定量15-17
• 1.5 双重等重标记的蛋白质组定量技术17-19
• 1.6 本论文研究内容19-20
• 第二章 金属元素标记结合质谱用于蛋白质 N-末端肽的鉴定及相对定量新方法研究20-40
• 2.1 实验部分20-23
• 2.1.1 仪器与试剂20-21
• 2.1.2 实验方法21-23
• 2.1.2.1 蛋白质胍基化修饰21
• 2.1.2.2 蛋白质金属标记和酶切21
• 2.1.2.3 表明键合 DITC 的硅球合成及与酶切肽段的结合21
• 2.1.2.4 腾冲嗜热菌全蛋白的提取21-22
• 2.1.2.5 金属元素对腾冲嗜热菌全蛋白样本 N-末端肽的标记22
• 2.1.2.6 质谱分析22-23
• 2.2 结果和讨论23-39
• 2.2.1 实验原理23-25
• 2.2.2 蛋白质 N-末端肽胍基化效率考察25-26
• 2.2.3 蛋白质 N-末端肽金属标记条件优化26
• 2.2.4 基于 DITC-硅球的 N-末端肽的分离及质谱鉴定26-29
• 2.2.5 基于 N-末端肽的蛋白质相对定量29-31
• 2.2.6 不同温度培养腾冲嗜热菌 N-末端肽的鉴定及相对定量31-39
• 2.3 本章小结39-40
• 第三章 (18)~O/金属等重标记结合质谱的蛋白质组绝对定量新方法研究40-59
• 3.1 实验部分40-45
• 3.1.1 仪器与试剂40-41
• 3.1.2 实验方法41-45
• 3.1.2.1 人肝微粒体定量串联体蛋白的制备41-42
• 3.1.2.1.1 人肝微粒体 QconCAT 质粒构建41
• 3.1.2.1.2 QconCAT 的表达和纯化41-42
• 3.1.2.2 定量肽段和内标肽段的制备42-43
• 3.1.2.2.1 QconCAT 蛋白的酶切及~(18)O 标记42
• 3.1.2.2.2 ~(18)O/~(16)O 肽段的金属标记42-43
• 3.1.2.3 人肝微粒体蛋白质的提取、酶切和金属标记43
• 3.1.2.4 质谱分析43-45
• 3.2 结果与讨论45-58
• 3.2.1 ~(18)O/金属等重标记的原理和技术路线45-46
• 3.2.2 ~(18)O/金属等重标记用于蛋白质绝对定量分析实验流程46
• 3.2.3 ~(18)O/金属等重结合质谱蛋白质组绝对定量方法的建立46-58
• 3.2.3.1 ~(18)O/金属标记效率的考察46-50
• 3.2.3.2 ~(18)O/金属标记肽段的稳定性考察50-51
• 3.2.3.3 ~(18)O/金属标记肽段在食谱碰撞池中的碎裂行为考察51-52
• 3.2.3.4 定量肽段母子离子对选择及质谱参数优化52-53
• 3.2.3.5 ~(18)O/金属标记肽段的色谱保留时间考察53-54
• 3.2.3.6 定量肽段标准曲线的建立54-55
• 3.2.3.7 ~(18)O/金属等重标记结合质谱的蛋白质组绝对定量方法的应用55-58
• 3.3 本章小结58-59
• 参考文献59-65
• 个人简历65-67
• 致谢67-68
• 综述68-78
• 参考文献74-78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 YAN Hui;HAO FeiRan;CAO QiChen;LI JiaBin;LI NanNan;TIAN Fang;BAI HaiHong;REN XiaoJun;LI XianYu;ZHANG YangJun;QIAN XiaoHong;;A novel method for identification and relative quantification of N-terminal peptides using metal-element-chelated tags coupled with mass spectrometry[J];Science China(Chemistry);2014年05期

2 王雪颖;张养军;王昕;佟巍;秦伟捷;毛心丽;钱小红;;一种蛋白质质谱分析中快速胍基化新方法[J];质谱学报;2011年05期

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本文编号：283223