mTOR信号通路在小鼠B淋巴细胞成熟及抗体产生中的作用及其机制

发布时间：2017-04-02 22:09

  本文关键词：mTOR信号通路在小鼠B淋巴细胞成熟及抗体产生中的作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：一、研究背景与目的雷帕霉素功能性靶蛋白(mechanistic target of rapamycin, mTOR)是一种高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在体内主要形成两种不同的复合物而行使功能,分别是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2). mTORC1由mTOR、Raptor (regulatory-associated protein of mTOR)、mLST8/GβL (G proteinβunit-like protein)和PRAS40组成。其作为一个中心调节分子能整合细胞内外信号,从而调控细胞代谢、生长、增殖和存活。雷帕霉素(rapamycin)可特异性抑制mTORC1的功能,并能作为一种免疫抑制剂用于临床。结节性硬化症复合体(TSC)是mTORC1最重要的上游调节因子,具有GTP酶活化蛋白(GTPactivating protein, GAP)活性,能使小GTP酶Rheb上的GTP分解成GDP,从而使Rheb失活。而Rheb作为mTORC1的直接上游,其活化状态可使mTORC1激活,进而活化其下游靶点磷酸化核糖体蛋白S6激酶(S6K)及转录起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1),从而促进细胞内蛋白翻译和核糖体发生。mTORC2包括mTOR、 mLST8/GPL、Rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR)、mSinl (SAPK interacting protein 1)和PRR5/Protor、mSinl、Rictor和PRR5/Protor是mTORC2特有的亚单位。在哺乳动物细胞缺失Rictor将导致mTORC2复合物的功能丧失。关于mTORC2的功能目前知之甚少,有文献表明在酵母及哺乳动物细胞,mTORC2可调控肌动蛋白聚合和细胞骨架重排。mTORC2可磷酸化AKT的疏水基序(HM)(Ser473位点),继而使其成为具有完全活性的激酶。AKT是调节细胞存活的关键激酶之一。越来越多的证据表明mTOR在免疫反应调节过程中起重要作用。mTOR可感受胞内外众多信号并整合进而调节免疫微环境；此外,mTOR在调节中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、T细胞及B细胞发生及功能方面起关键作用。B淋巴细胞(B lymphocyte)简称为B细胞,主要存在于血液、淋巴结、脾、扁桃体及其他黏膜组织。B细胞是体内产生抗体(免疫球蛋白)的细胞,并具有抗原提呈功能,是非特异性免疫反应及特异性体液免疫应答反应的主要参与者。B细胞的功能与其发育程度密切相关,其发育主要分为两个阶段——抗原非依赖阶段和抗原依赖阶段。从造血早期祖细胞发育分化为成熟B淋巴细胞,这个阶段是在中枢免疫器官骨髓中进行,它不依赖于抗原的刺激,故称抗原非依赖阶段。该阶段分为早期祖B细胞(Progenitor B cell, Pro-B)、晚期Pro-B细胞、前B细胞(Precursor of B cell, Pre-B)、不成熟的B细胞(Immature B)和成熟的B细胞5个时期。抗原依赖阶段通常发生在外周免疫器官,出现于B细胞对抗原产生应答后。B细胞接触抗原并分化为记忆B细胞或浆细胞。B细胞离开骨髓时,功能尚未成熟,处于过渡1阶段(T1)。当随着血流进入脾脏时,B细胞逐步发育为过渡2阶段(T2)、成熟(Mature B)和边缘区B细胞(marginal zone B cell, MZB)。T2 B细胞在脾脏和淋巴结的滤泡中分化为成熟的滤泡B细胞(follicular B cell,FOB),在脾脏中分化为边缘区B细胞。B细胞发育、分化、增殖受阻,或浆细胞功能异常将会导致抗体合成或分泌缺陷,在临床上称为原发性体液免疫缺陷病。在不同类型的抗体缺陷疾病中,主要的异常存在于B细胞成熟的不同阶段或成熟B细胞对抗原刺激的应答过程中。这类疾病的临床典型特征是反复的化脓性细菌感染,若不积极治疗患者多于成年前死亡。也有大量文献报道B细胞与类风湿性关节炎@A)、系统性红斑狼疮(SLE)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、桥本甲状腺炎、Graves病、强直性脊柱炎、重症肌无力、胰岛素依赖性糖尿病(DM)及RF阴性的青少年关节炎等多种自身免疫性疾病密切相关。mTOR作为一个重要的免疫调节分子,对于机体的体液免疫及生发中心形成起着关键作用。已有文献证实mTOR参与小鼠体液免疫反应,脾脏的生发中心形成、抗体亲和力成熟、体细胞超突变(SHM)及免疫球蛋白类型转换(CSR)等多个方面。有文献表明mTORC1上游的抑癌基因pten参与了B1群、边缘带B细胞群(MZB)的分化及B细胞体外增殖和存活。同样,在另外的研究中也发现,mTORC1上游抑制基因tsc1参与了B细胞成熟及边缘带B细胞(MZB)的发生。在关于mTORC2的研究中,研究者发现sin1敲除的祖B细胞向IgM+的不成熟B细胞分化减少,其il-7r及rag重组酶(rag1和rag2)基因表达水平升高,从而导致祖B细胞V(D)J重排活性增加。由于mTORC2调控AKT的磷酸化,从而推断AKT是mTORC2调节RAG表达过程的主要调控点。小鼠祖B细胞敲除Akt2与敲除sin1出现相似的RAG表达升高。小鼠B细胞敲除Akt2的研究证实AKT对于MZB及B1细胞群的发生及促进FOB的存活也起着重要作用。因此,mTORC2可能调节成熟B细胞的存活、增殖,并且对于边缘带B细胞和B1细胞的发育十分重要。目前尚无研究表明mTORC1及mTORC2的核心蛋白Raptor与Rictor分别对B淋巴细胞的稳态和功能起何种作用。基于此,我们利用Cre-loxp系统建立了小鼠B淋巴细胞分别特异性敲除raptor和rictor的动物模型(CD19-Cre; raptor-loxp; rictor-loxp)并开展了相关研究。二、研究方法1、应用Cre-loxp系统,我们分别成功构建了稳定遗传的B淋巴细胞敲除raptor和敲除rictor的小鼠模型。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定,用western blot技术确定敲除效果。2、通过流式细胞术分析小鼠骨髓及脾脏等淋巴组织,检测rictor缺失对小鼠B淋巴细胞发育的影响。3、分别通过ELISA检测分析敲除raptor和敲除rictor对小鼠B淋巴细胞体液免疫功能的影响。4、通过流式细胞术分析rictor缺失对小鼠B淋巴细胞凋亡的影响。5、通过qPCR技术分析敲除rictor对B淋巴细胞bcl-2、rag2及il-7r基因表达的影响。三、研究结果1、成功构建了稳定遗传的B淋巴细胞特异性敲除raptor小鼠模型利用Cre-loxp系统成功构建了稳定遗传的B淋巴细胞特异性raptor敲除小鼠(B cell-raptor KO)。经PCR检测基因型及western blot检测B淋巴细胞中Raptor及其下游pS6的蛋白表达水平已证实敲除小鼠的B淋巴细胞的确缺乏Raptor蛋白的表达,且其mTORC1的活性下降。2、B淋巴细胞特异性敲除raptor影响体液免疫功能我们初步检测了B淋巴细胞特异性敲除raptor的小鼠的B细胞功能。利用经典的胸腺依赖性抗原OVA免疫小鼠的方法得到产生特异性抗体的小鼠,通过ELISA检测特异性抗体的水平,发现B细胞敲除raptor导致OVA-IgG、OVA-IgM的水平下降。3、成功构建了稳定遗传的B淋巴细胞特异性敲除rictor小鼠模型利用Cre-loxp系统成功构建了稳定遗传的B淋巴细胞特异性rictor敲除小鼠。经PCR检测基因型及western blot检测B淋巴细胞中Rictor的蛋白表达水平已证实敲除效果,且其mTORC2的活性下降。4、B淋巴细胞特异性敲除rictor影响B细胞成熟,导致骨髓B细胞rag2和il-7r的mRNA表达水平增加采用流式细胞学的方法分析了小鼠体内B细胞亚群,结果显示：①骨髓中B细胞数量与对照相比无差异,但进一步分析骨髓中各阶段B淋巴细胞显示：Pre B cells明显升高,而ImmatureB细胞显著减少。提示B淋巴细胞在发育过程中可能部分阻断在Pre B cells阶段而无法向一下阶段分化并进一步成熟。采用qPCR的方法分析了小鼠骨髓B淋巴细胞中rag2及il-7r的mRNA表达水平,发现较对照野生型相比,敲除鼠的rag2及il-7r的mRNA表达上调,这可能是B细胞发育中阻断在Pre-B阶段的原因。②敲除小鼠的脾脏中B细胞明显减少,进一步分析脾脏中各个B细胞亚群发现,Transitional B、Follicular B cells及Marginal zone各群的比例在敲除组及对照组中无明显差异。提示Rictor敲除导致脾脏中成熟B细胞减少,但不影响外周淋巴组织的B细胞亚群分布。③同时,我们还检测了主要分布在腹腔的B1细胞群,结果显示B细胞敲除Rictor导致B1细胞减少。5、B细胞敲除rictor导致B细胞凋亡增多、Bcl-2表达水平下降我们采用了AnnexinV标记脾脏B细胞,通过流式细胞仪检测AnnexinV阳性细胞率,结果显示敲除小鼠的脾脏B细胞较对照小鼠凋亡增加。并且为了探讨敲除rictor引起B细胞凋亡增加的分子机制,我们提取敲除小鼠脾脏B淋巴细胞的RNA,利用qPCR技术分析了bcl2家族的经典抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达水平,发现敲除小鼠B细胞bcl-2表达水平较对照野生型小鼠相比明显下降。6、B淋巴细胞特异性敲除rictor影响体液免疫功能我们检测了B淋巴细胞特异性敲除rictor的小鼠的B细胞功能。利用OVA免疫小鼠的方法得到产生特异性抗体的小鼠,通过ELISA检测特异性抗体的水平,我们发现B细胞敲除rictor导致OVA-IgM及OVA-IgG的水平较对照野生型小鼠相比明显减少。四、结论1、成功构建了稳定遗传的B淋巴细胞特异性敲除mTORC1的主要组分raptor和mTORC2的主要组分rictor的小鼠模型,经PCR及Western blot验证了敲除效果。2、mTOR信号通路影响小鼠B淋巴细胞成熟。我们发现敲除rictor的小鼠骨髓中Pre B细胞群增多,外周成熟B细胞减少,骨髓B细胞中rag2和il-7r的mRNA表达水平增加。3、敲除rictor促进小鼠脾脏B淋巴细胞凋亡。4、mTOR信号通路影响小鼠B淋巴细胞体液免疫应答。敲除raptor及敲除rictor的小鼠都出现对OVA免疫产生的特异性抗体水平(OVA-IgM、OVA-IgG)下降。
【关键词】：mTOR Raptor Rictor B淋巴细胞成熟 抗体生成 凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 1. 前言18-31
• 1.1 B淋巴细胞18-21
• 1.1.1 抗原非依赖期18-20
• 1.1.2 抗原依赖期20-21
• 1.1.3 B1细胞21
• 1.2 B淋巴细胞与疾病21-23
• 1.2.1 先天性B细胞缺陷21-22
• 1.2.2 自身免疫性疾病22-23
• 1.2.3 慢性B淋巴细胞白血病23
• 1.3 MTOR信号通路23-26
• 1.4 B淋巴细胞与MTDR26-27
• 1.5 基因敲除与CRE-LOXP系统27-31
• 1.5.1 cre重组酶28
• 1.5.2 loxp(locus of X-over P1)序列28
• 1.5.3 cre-loxp系统的特性28-29
• 1.5.4 cre-loxp系统在基因打靶中的应用29-31
• 2. 材料与方法31-46
• 3. 结果46-67
• 3.1 构建B淋巴细胞特异性敲除raptor小鼠(B cell-raptor KO)46-48
• 3.2 B淋巴细胞特异性敲除raptor影响B细胞体液免疫功能48-50
• 3.3 构建B淋巴细胞特异性敲除rictor小鼠(B cell-rictor KO)50-52
• 3.4 B淋巴细胞特异性敲除rictor影响骨髓B细胞分化52-57
• 3.5 B淋巴细胞特异性敲除rictor影响脾脏B细胞成熟,但不影响其亚群分布57-60
• 3.6 敲除rictor导致脾脏B细胞凋亡增加60-62
• 3.7 B淋巴细胞特异性敲除rictor导致B1细胞减少62-64
• 3.8 B淋巴细胞特异性敲除rictor影响B细胞体液免疫功能64-67
• 4. 讨论67-70
• 5. 结论70-71
• 参考文献71-76
• 附录 中英文缩略词对照表76-78
• 硕士研究生期间发表论文情况78-79
• 致谢79-80

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