1、RGD肽与尿激酶B链融合蛋白表达载体的构建、表达及生物活性的初步分析 2、尿激酶氨基末端基因转染抗肿瘤转移的实验研究

发布时间：2020-10-24 11:41

　　 一、RGD肽与尿激酶B链融合蛋白表达载体的构建、表达及生物活性的初步分析 将化学合成的RGD肽编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后克隆至原核表达质粒pBV220中,在P_RP_I启动子的作用下经42℃热诱导在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的9.2%,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到分离的融合基因的表达产物,经western blotting分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,其体外活性分析显示具有一定的纤溶和抗血小板聚集的活性。 二、尿激酶氨基末端基因转染抗肿瘤转移的实验研究 为探讨尿激酶氨基末端片段(ATF)基因转移对肿瘤细胞转移的影响,将ATF基因克隆并重组入真核表达载体pcDNA3,得pcDNA3-ATF;用脂质体Lipofectin介导将pcDNA3-ATF导入uPA和uPAR均有表达的人高转移性肺癌PG细胞系和人乳腺癌MCF-7细胞系。用反转录PCR(RT-PCR)检测转染细胞ATF基因的表达;观察ATF基因转移对肿瘤细胞体外侵袭人工基底膜能力的影响;经裸鼠皮下接种肿瘤细胞复制自发性肿瘤转移模型,观察转ATF基因细胞成瘤性和转移性的改变。结果表明,转染ATF基因后,肿瘤细胞呈现ATF基因的明显表达;体外侵袭穿透人工基底膜的能力明显减弱;体内接种实验表明,原位成瘤性不受影响,但自发性转移能力下降。上述结果揭示ATF基因转染后的肿瘤细胞通过ATF基因的表达与尿激酶竞争其受体的结合可在一定程度上抑制肿瘤细胞的恶性表型。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：1999
【中图分类】：R346
【部分图文】：

分子量标准21uPAB链PCR(R)uB扩增结果o一RuB和pBv220一uB的构建肤的寡核昔酸正、反义链退火及经EcoRI和Pstl双酶切表达质粒pBV220一RuB(图l酶切后与经EcoRI和Psrll后平端连接，构建成B链的DH5a，挑取若干转化子培，pBv22o一RuB阳性重组子用片段，pBV22o一uB阳性重组，图s和图6分别为pBV22过DNA重组构建了原核表

酶切鉴定

pBV22O一RuB测序结果
【参考文献】

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1 宋安,刘建宁,余瑞荣,崔大敷,周同明,崔恒苒,朱德煦;尿激酶对纤维蛋白低亲和性的结构基础——Ⅱ.尿激酶A链149—157片段对纤维蛋白促进tPA激活纤溶酶原的抑制作用[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1991年11期

2 刘士辉,黄培堂,黄翠芬;组织型纤溶酶原激活剂突变体的构建、表达及特性分析[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1995年04期

3 赵庆国,黄培堂,刘士辉;人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的高效表达[J];生物工程学报;1997年01期

本文编号：2854413