结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化
【部分图文】：
坏阕⑹痛砦螅?可变剪接；核糖体移位；漏注释等)，给准确解析相应物种的生物学机制带来了困扰[18]。利用蛋白质组学数据，结合基因组数据、转录组数据来研究基因组注释问题，被称为蛋白质基因组学(Proteogenomics)[19]。近10年来，蛋白质组学直接用于基因组的注释已经越来越受到相关领域的关注。本课题组前期基于深度覆盖的精准蛋白质基因组学技术[20,24]和比较基因组学策略，完成了H37Rv基因组数据库的重注释，发现了22个结核遗漏注释基因，矫正了28个N端注释错误基因(图1，尚未发表)。此发现有利于结核新型特异性免疫原性分子标志物筛选，为结核病的快速、精准临床检测提供基础理论和原始创新技术支持。从TubercuList库中下载了H37Rv(http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/)基因组注释数据库，共4031个基因，包含4018个编码基因和13个假基因。六阅读框翻译数据库由中国科学院计算技术研究所pFind团队与我们课题组合作开发的蛋白质基因组学软件pAnno对NCBI中结核分枝杆菌H37Rv的基因组文件(NC000962.3.fna)按照正链和互补链上连续的3个核苷酸翻译一个图1结核分枝杆菌H37Rv蛋白质基因组学分析流程图Fig.1WorkflowofMycobacteriumtuberculosisH37Rvproteogenomicanalysis.氨基酸的规则翻译，使用终止子到终止子的翻译模式，采用MTB特殊的3种起始密码子ATG、GTG和TTG，共翻译得到141851个开放阅读框(Openingreadingframe，ORF)。与已注释的蛋白质序列数据库进行合并，经过严格FDR筛选，结合谱图人工核实、肽段合成验证、转录丰度、基因组多序列比对，获得了一批质量可信
?H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化：010-64807509：cjb@im.ac.cn1777约420bp，与预期的目的片段大小一致(图2A)，表明成功获得目的基因Rv2742。纯化的Rv2742目的片段与pMD18-T连接转化后进行菌落PCR验证，在目的条带处成功获得特异性条带(图2B)，且测序序列正确。EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pMD18T-Rv2742质粒6h，酶切片段约为420bp，与预期大小相符(图2C)。EcoRⅠ和HindⅢ双酶切质粒pMAL-c2X，酶切片段约为6478bp(图2D)，与预期相符。将双酶切后回收的目的片段与载体片段连接转化进行菌落PCR验证，在目的条带处获得特异性条带(图2E)，说明成功构建重组表达质粒pMAL-c2X-Rv2742-2。2.2四种表达载体均未实现Rv2742目的蛋白的诱导表达经Glycine-SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE[26]电泳结果分析，如图3A所示，发现在28℃1mmol/LIPTG诱导6h后，pGEX-4T-2系统表达的Rv2742目的融合蛋白(分子量为40.85kDa)主要分布在沉淀中，但在诱导后上清中并没有明显的新增条带，说明以pGEX-4T-2系统表达的Rv2742目的融合蛋白主要以包涵体形式存在。如图3B、3C、3D所示，分别以pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X系统表达的Rv2742目的融合蛋白(分子量分别为28.16、18.04、56kDa)在诱导后上清与沉淀中均未出现明显的新增特异性条带，说明以pET-32a、pET-28a以及pMAL-c2X表达的Rv2742目的融合蛋白均未能成功实现诱导表达。综上所述，以H37Rv基因组DNA克隆的Rv2742基因序列为模板所构建的pGEX-4T-2-Rv2742
赵加玲等/结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化：010-64807509：cjb@im.ac.cn1783图8IPTG诱导表达Rv2742蛋白生长曲线的测定Fig.8DeterminationofgrowthcurveofexpressionofRv2742fusionproteininducedby0.5mmol/LIPTG.3讨论大肠杆菌是一种基因组G+C含量低(<50%)的革兰氏阴性菌，而结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是一种基因组G+C含量高(>65%)的革兰氏阳性放线菌[28]，放线菌基因组的典型特征就是基因组G+C含量高。结核分枝杆菌G_和C_结尾末端的密码子具有很强的偏倚性，第3个位点的密码子(G+C)含量高达83%[29]。密码子偏倚性影响翻译过程中氨基酸插入的准确性、多肽折叠和mRNA序列的稳定性等几方面[30]。结核分枝杆菌目的基因在大肠杆菌中不易表达可能主要是由于G+C含量高和独特密码子的使用[31]。生物体中基因所使用的密码子和tRNA的丰度有着强的正相关性。依照物种的偏好性对mRNA的序列进行优化，将目的基因的密码子替换成宿主细胞常用的密码子，能够增加tRNA的结合效率从而提高蛋白质表达水平。本次实验研究的结核新基因Rv2742编码蛋白分子量本身不大，pET-32a和pET-28a虽然同属pET载体，标签大小对小蛋白的表达有一定程度的影响，所以在实验过程中考虑到使用不同种类和大小标签的pET载体。但仅在密码子优化后，利用pMAL-c2X原核表达系统才在上清和沉淀中都实现了表达，沉淀中表达含量要比可溶性部分高。后续实验需要进一步考虑对以包涵体形式表达的蛋白进行变性和复性。诱导后上清虽然实现了可溶性诱导表达，但表达含量较低，可从温度、IPTG浓度、抗生素浓度
【参考文献】
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