登革病毒(Dengue Virus, DENV)是一种通过蚊子(以埃及伊蚊和白纹伊蚊为主)传播的病毒,属于黄病毒属的黄病毒科。DENV含有四个血清型：DENV1, DENV2, DENV3及DENV4。各种血清型的DENV之间存在60-70%的同源序列。人类感染了DENV的其中任何一种血清型后将引发从轻度自限性登革热(Dengue Fever, DF)到重度甚至死亡的登革出血热(Dengue Hemorrhagic Fever, DHF)及登革休克综合征(Dengue Shock Syndrome, DSS)。 目前,对于登革热的研究已经持续进行了60多年,仍然没有安全有效的疫苗及治疗药物得以认证使用,因而近年来登革热已逐渐成为影响全球热带及亚热带地区的主要公共卫生问题。每年世界上大约有5000万-1亿人感染DENV,其中大约50万人会出现严重的并发症从而引发2.5万人死亡。机体初次感染任一血清型的DENV所诱发的抗体能够中和同一血清型的再次感染,但是当机体再次感染其他三种不同的血清型时,此异型中和抗体会促进Fcγ受体阳性细胞内病毒的摄入及复制,引发抗体依赖增强作用(antibody-dependent enhancement, ADE),从而诱发登革热严重的并发症如DHF/DSS等。ADE作用的存在是登革热疫苗研发的主要障碍。因此,如果能够对抗体诱导中和作用的机制及抗原位点有了全面深入的理解,对于疫苗的研发策略以及临床试验中疫苗效果及安全性的评估有着非常重要的意义。 DENV是一种有包膜的单股正链RNA病毒,基因组长度大约11kb,编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。三种结构蛋白分别是衣壳蛋白(capsid protein, C),膜蛋白(membrane protein, M)和包膜蛋白(envelope protein, E)。7种非结构蛋白分别为NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。E蛋白是成熟DENV颗粒表面的主要结构蛋白,作为宿主体液免疫应答的主要抗原靶标,在受体的结合及病毒与细胞膜融合中起着关键性的作用。在病毒进入宿主细胞的过程中,内涵图环境的酸性化触发了病毒表面的E蛋白二聚体发生构象变化成为三聚体,该变化诱发了病毒与宿主细胞膜的融合,最终使得DENV的RNA基因组释放进入细胞质并启动了病毒的感染。目前人们已经通过结晶学(Crystallography)技术对虫媒病毒及蜱传脑炎的E蛋白进行了结构学分析,病毒颗粒表面的E蛋白含有3个结构区：位于中心的Ⅰ区(EDⅠ)；含有融合环(fusion peptide, FP)的延展Ⅱ区(EDⅡ)；以及呈免疫球蛋白样折叠的含有10个β-strands (A-G及AxCxDx)的EDⅢ。其中EDⅢ作为一个独立暴露于病毒表面的区域,成为了制备保护性单克隆抗体的重要抗原靶标,相关研究亦表明EDⅢ含有非常重要的中和抗原表位。 在本实验室的前期工作中,我们用杂交瘤技术制备了一组抗DENV1-4EDⅢ的单抗,用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫荧光试验(immunofluorescence assay, IFA)和蛋白印迹实验(western blot,WB)对这些单抗的免疫反应性进行了分析,在此基础上,借助已经建立的中和实验方法学enzyme-linked immunospot based micro-neutralization test (ELISPOT-MNT)对单抗的中和活性进行检测,其中2株具备针对DENV1-4较高交叉中和活性的单抗3E31及2D73被选用进行下一步的功能和结构学分析以期能够对这2株中和抗体的中和作用机制进行全面深入的了解。 由此,本研究的目的主要有三个,一、寻求一种能够精确滴定DENV的新方法为后续的实验做好准备；二、通过一些功能实验对交叉中和抗体进行分析；三、借助结晶学技术,从结构上分析2株交叉中和抗体的中和作用机制,为登革热疫苗及治疗性药物的研发提供帮助。 由此,本研究分为以下三个方面的内容： 第一部分：建立基于ELISA的TCID50方法学(TCID50-ELISA)滴定DENV 在对于DENV的研究中,常常因为不能准确地滴定DENV而受到了阻碍,目前人们建立的DENV滴定方法包含噬斑实验(plaque assay, PA),半数组织感染量测定(tissue cultureinfectious dose-50assay, TCID50),荧光焦点实验以及基于免疫荧光的荧光激活细胞分选术(FACS)。作为DENV滴定的金标准,PA及TCID50方法均受到了病毒株的传代及细胞系的种类的限制,很多DENV临床分离株并不能在单层细胞上形成噬斑或者肉眼可见的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),影响了滴定结果的判断。另外,这两种方法均需要实验者每天借助显微镜进行人工检测,耗时耗力。而相比之下荧光焦点实验及FACS能够更精确快速地进行病毒滴定,缺点是该两种方法需要具备丰富经验的实验者及较好的实验室条件。因而,在我们的研究的最初,为了后续实验的顺利进行,试图建立一种全新的DENV滴定方法学以克服传统方法的缺陷。NS1蛋白是DENV的一种多功能糖蛋白,也是DENV复制的主要标志,其主要以分泌及膜表达两种方式存在,其中分泌的NS1被认为和上清中DENV的滴度相关。本实验室在前期的研究中建立了一种NS1抗原捕获ELISA方法,在本研究中,我们在传统的TCID50方法学的基础上,借助已经建立的NS1抗原捕获ELISA检测病毒感染上清中的NS1蛋白,以替代传统方法学中的肉眼观察CPE,经过分析比较后证实这种TCID50-ELISA方法具备较好的准确性和重复性,且操作简便,能够替代传统的TCID50-CPE及PA方法学进行DENV的滴定。 第二部分：四型交叉抗DENV EDⅢ单克隆抗体的功能鉴定 在本实验室的前期工作中,借助毕赤酵母真核表达体系表达DENV1-4EDⅢ重组蛋白,随后利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了一组抗DENV1-4EDⅢ的单抗,并对该组抗体的血清型、交叉反应性及中和活性进行了鉴定。最终发现其中2株交叉反应性单抗具备针对DENV四个血清型较高的中和活性,命名为3E31及2D73。在本研究中,我们通过一系列相关实验对3E31及2D73的功能进行全面的鉴定。首先我们用表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance, SPR)对2株抗体与DENV1-4EDIII及DENV1-4E的亲和力进行了进一步的动态分析。SPR不仅可以检测出抗EDⅢ单抗与EDⅢ及E蛋白抗原动态相互作用情况下的平衡解离常数(equilibrium dissociation constant, KD),而且可以得到EDⅢ单抗和抗原的结合常数(association constant,Ka)及解离常数(dissociation constant, Kd),以及表示抗体可及性(accessibility)的单抗活性百分数。另外Ka及Kd值也为下一步抗原抗体共结晶提供了指导意义。结果显示这2株单抗的亲和力很高均达到了nM水平,且针对四个血清型EDⅢ抗原的亲和力无明显差异,结合中和实验的结果,并未发现两者之间存在相互关系。更为重要的是,在膜融合抑制实验中,3E31显示出了抑制融合作用,而2D73却表现出了显著的膜融合增强作用,这一现象到目前为止从未被报道过。最后,我们对这2株交叉中和单抗的ADE活性进行了鉴定,结果显示它们显示出了不同的ADE活性,单抗3E31不会引发针对四个血清型DENV的感染增强作用,而单抗2D73却能够在DENV2, DENV3及DENV4的感染后引发ADE作用。基于以上的功能鉴定结果,我们推测单抗3E31及2D73的中和作用机制可能不同。 第三部分：结晶学技术分析四型交叉抗DENV EDⅢ中和抗体的中和作用机制 为了对单抗2D73及3E31的中和作用机制进行更深入的探讨,将抗体的Fab段与E蛋白Ⅲ区抗原进行共结晶,获取晶体后通过X-ray衍射后分别获取了2组高分辨率的结晶学数据,分辨率分别为2.2A及2.0A。通过软件对数据进行三维立体结构学分析,最终确定该2株单抗结合的抗原表位。结果显示这2株单抗识别了2个不同但稍有重叠的表位。单抗3E31的抗原表位主要集中于ABloop及E strand。其中形成氢键及盐桥的氨基酸在DENV四个血清型中完全保守,这解释了该单抗具备四型交叉中和能力。单抗2D73识别的表位主要集中于Astrand及G strand,这些氨基酸同样在DENV四个血清型中高度保守。通过与目前已发表的其他相关结构进行比较后发现,3E31识别的表位与单抗2H12相同,而2D73的表位则与单抗4E11、1A1D-2所识别的表位非常接近,人们把这类单抗称为"A strand"单抗。随后,通过对2D73表位及3E31表位在完整DENV颗粒表面的融合前E蛋白二聚体表面暴露情况进行分析,发现3E31表位完全隐藏于病毒颗粒内部,而2D73表位仅有极小部分暴露在外。那么该2株抗体是如何结合完整病毒并进行中和作用的?而当E蛋白二聚体经过构象变化转变为三聚体后,3E31表位仍然隐藏,2D73表位却大部分暴露,该结果与功能研究中的膜融合抑制实验结果相呼应。结合功能实验的结果,我们最终对2株四型交叉中和单抗3E31及2D73的中和作用机制进行了深入明了的阐述,并进一步为抗DENV疫苗及治疗性药物的研发提供了新的思路,同时也为理解ADE的发生机制提供了帮助。 小结 通过以上三部分的研究结果发现,本研究的具有以下三个创新之处,其中包括： 一、利用我们建立的DENV特异性NSl抗原捕获ELISA,建立了一种新的基于传统TCID50测定的TCID50-ELISA方法学,在6天时间内对DENV1-4进行精确的滴定。TCID50-ELISA方法不仅显示出了与传统的噬斑实验及TCID50结果的一致性,还具备较好的重复性。原因在于我们通过检测NS1蛋白替代CPE的观察,从而排除了不同操作者及实验室带来的主观差异。另外,TCID50-ELISA方法还克服了传统的噬斑实验及TCID50-CPE方法学的缺点,能够同时运用于C6/36, Vero E6, BHK-21及Vero cells等不同的敏感细胞株,且不受细胞株状态的影响。另外,TCID50-ELISA方法亦能够对临床分离株进行精确的滴定。基于很好的准确度和重复性,TCID50-ELISA可以替代传统的方法对DENV进行滴定,对登革热的研究起到了促进作用。 二、在本研究中,我们通过一些功能实验对2株抗EDⅢ交叉反应中和抗体3E31及2D73进行了鉴定。2株单抗均能中和DENV四个血清型的感染,且单抗与DENV结合的亲和力及中和能力呈温度依赖性。这两株单抗在膜融合抑制实验及ADE实验中均表现出了不同的作用,提示二者的中和作用机制可能并不相同。本研究发现抗病毒中和抗体2D73能够在病毒与细胞膜融合过程中起到增强作用,据我们所知,过去并未出现相关报道。这一新发现为后续人们对抗病毒中和抗体的功能研究提供了新思路。另外,研究发现中和单抗3E31不具备ADE活性,提示此抗体具备成为免疫治疗性抗体的潜在可能性。 三、为了对中和单抗3E31及2D73的中和作用机制的结构学基础进行研究,本研究中,我们通过结晶学技术将单抗的Fab段与EDⅢ蛋白进行抗原抗体的共结晶。通过X-ray对晶体进行衍射后,收集高分辨率的数据进行三维立体晶体结构的数据分析。根据最终解析的抗原抗体结合的晶体结构,我们对单抗3E31和2D73所识别的抗原表位有了清晰立体的了解。随后,我们通过模型模拟分析这2个表位分别在融合前E蛋白二聚体全长及融合后三聚体的暴露程度,以及单抗在等病毒生命周期内的不同形态下(未成熟及成熟颗粒)的结合情况。通过以上的结构分析,结合前期的功能研究,我们对单抗3E31和2D73的中和作用机制及ADE发生机制进行了深入的探讨,弥补了目前人们对这两方面理解的不足,对登革热研究中有效疫苗的研发和评估非常关键。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R373.33;R3416
【文章目录】：摘要
ABSTRACT
前言
参考文献
50)检测方法滴定登革病毒'>第一部分 建立基于ELISA的半数组织感染剂量(TCID
50)检测方法滴定登革病毒
1 材料和方法
1.1 试剂与材料
1.2 方法
2 数据分析
3 结果
3.1 确定TCID50-ELISA方法孵育时间点
3.2 TCID50-ELISA,TCID50-CPE及噬斑实验的定量及定性比较
4 讨论
5 参考文献
第二部分 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ区中和抗体的功能研究
1 材料和方法
1.1 试剂与材料
2 结果
2.1 抗DENV EDin单克隆抗体的制备及鉴定
2.2 表面等离子共振技术（SPR）动态分析登革病毒EDⅢ单克隆抗体的亲和力
2.3 单抗3E31与2D73在病毒与细胞膜融合中所起到的作用
2.4 单抗3E31及2D73与DENV的亲和力及中和活性呈温度依赖性
2.5 抗EDⅢ单抗的抗体依赖增强作用（ADE）分析
3 讨论
4 参考文献
第三部分 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ区中和抗体的结构研究
1 材料和方法
1.1 主要试剂和材料
1.2 方法
2 结果
2.1 Fab及Fab-EDⅢ抗原抗体复合物的制备及纯化
2.2 Fab 3E31-EDⅢ及Fab 2D73-EDⅢ结晶体条件的优化
2.3 Fab 3E31-EDⅢ及Fab 2D73-EDⅢ结晶体特性
2.4 单抗3E31及2D73与抗原结合的结构学分析
2.5 结构学数据分析抗EDⅢ单抗ADE作用机制
2.6 结构学数据结合功能研究结果分析抗EDⅢ单抗的中和作用机制
3 讨论
4 参考文献
全文小结
中英文对照缩略词表
综述
参考文献
学习期间完成的相关论文
参加国际国内会议
致谢
统计学审稿证明
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