呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞诱导氧化应激对TLR3表达的影响

发布时间：2017-04-05 00:14

  本文关键词：呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞诱导氧化应激对TLR3表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）为副粘病毒科肺炎病毒属，，是有包膜非节段性的单负链RNA病毒，也是引起世界范围内婴幼儿严重下呼吸道感染的最常见病原体，并与后来的哮喘发生发展和肺功能异常有关。RSV感染可通过氧化应激（oxidative stress）造成机体的损伤，引起机体的一些病理生理变化，从而引起一些疾病的发生；如RSV感染呼吸道上皮细胞后，诱导细胞产生大量细胞因子、趋化因子、活性氧等生物活性介质，导致婴幼儿毛细支气管炎、肺炎、哮喘等疾病的发生。目前国内氧化应激研究主要集中在病毒与氧化应激的关系、对患者体内氧化应激状态的认识上，而对氧化应激所介导的Toll样受体的研究相对较少。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）为I型跨膜蛋白，是识别病原体的重要受体，它们识别细菌、病毒或环境中的配体，启动天然免疫反应和调节获得性免疫反应。TLR3介导的信号转导通路参与激活呼吸道上皮细胞，分泌大量炎症免疫相关细胞因子，在RSV感染引起肺炎的发生发展过程中发挥重要作用。本文通过探讨RSV感染A549细胞诱导氧化应激产生并给予抗氧化剂和氧化促进剂进行处理，初步研究RSV感染时诱导氧化应激影响TLR3水平及其主要信号分子的表达变化，为研究RSV的致病进行有效预防和控制等提供新的思路和理论依据。 目的：探讨RSV感染人肺上皮细胞（A549细胞）诱导氧化应激产生后，Toll样受体3（Toll-like receptor3，TLR3）的水平变化，初步研究氧化应激对TLR3活化及其主要信号分子的影响。研究该调节途径可能为RSV感染的致病机理、对所致疾病的有效预防和治疗等提供新的思路和重要的研究基础，有重要的现实意义。 方法：以RSV感染体外培养的A549细胞，并分别给予氧化剂和抗氧化剂进行处理，再以相同RSV感染，于感染后4h、8h、12h和24h不同时间点收集细胞和细胞培养上清，并以未感染病毒的A549细胞为正常对照组。①用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同组别TLR3、核内转录因子κB（nuclear factor-κ-binding,NF-κB）p65、干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor3, IRF3）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）mRNA的表达量变化；②用WST-1法检测SOD活力；③硝酸还原酶法检测细胞培养上清中一氧化氮（nitric oxide,NO）的含量；④化学法检测细胞培养上清中活性氧指标羟自由基（hydroxy radical，OH·）的水平。 结果：①在mRNA转录水平，在RSV感染不同时间点上调TLR3、NF-κB基因转录水平表达，下调IRF-3、SOD基因转录水平表达，而且其表达量与感染之间有时间依赖性关系；在加入抗氧化剂NAC后，TLR3、NF-κB的表达虽有上调，但表达量都比感染组同时间点下降，IRF-3、SOD的mRNA比感染组相同时间点的表达量下调不明显。在加入氧化剂H_2O_2后，TLR3、NF-κB的mRNA表达比感染组相同时间点的表达量明显升高，且升高有差异性，IRF-3、SOD的mRNA比感染组相同时间点的表达量下调更明显，且降低有差异性。②WST-1法检测SOD：RSV感染组随时间点的延长SOD活力逐渐下降，给予抗氧化剂NAC处理后，SOD活力与感染组相比下调不明显；给予氧化剂H_2O_2处理后，SOD与感染组相比表达明显下调；③硝酸还原酶法检测细胞培养上清NO的含量：RSV感染组NO含量逐渐升高，在给予抗氧化剂NAC处理后NO含量与感染组同一时间点相比降低；给予氧化剂H_2O_2处理后，NO的含量与感染组相比明显升高；④化学法检测细胞培养上清中活性氧指标OH·含量：在RSV感染组，随着感染时间点的延长OH·的含量逐渐升高，在给予抗氧化剂NAC后，OH·的含量与感染组相比是降低的；给予氧化剂H_2O_2处理后，OH·的含量与感染组相比明显升高。以上结果表明NAC和H_2O_2分别起到了抑制和激动氧化应激的作用，从而影响了TLR3转录水平的表达情况，进一步影响了下游的一些主要炎性因子变化。 结论：RSV感染A549细胞可诱导氧化应激的产生，在感染组，RSV感染可使TLR3表达上调；在加入抗氧化剂NAC后，再行相同RSV感染，虽上调TLR3的表达，但表达量比感染组相同时间点的下降；在加入氧化剂H_2O_2后，再行相同RSV感染，TLR3的mRNA表达比感染组相同时间点表达量明显升高。用氧化剂和抗氧化剂处理后，TLR3及其下游主要信号分子的表达出现明显的变化，表明呼吸道合胞病毒感染活化TLR3的表达可能是通过氧化应激途径来调节的。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 核转录因子κB 氧化应激 Toll样受体3 A549细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 英文缩略词表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 1 前言14-16
• 2 材料和方法16-27
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 病毒16
• 2.1.2 细胞16
• 2.1.3 试剂16-17
• 2.1.4 仪器和设备17
• 2.2 方法17-27
• 2.2.1 溶液的配制17-19
• 2.2.2 病毒增殖及病毒感染量测定19
• 2.2.3 细胞培养与病毒接种19
• 2.2.4 实验分组与标本收集19-20
• 2.2.5 A549 细胞培养上清中 OH·检测20-21
• 2.2.6 TLR3、NF-κB p65、IRF-3、SOD 在 RSV 感染组和 NAC，H2O2 干预组的 mRNA 转录水平检测21-24
• 2.2.6.1 A549 细胞总 RNA 提取21
• 2.2.6.2 RNA 定性与定量分析21-22
• 2.2.6.3 两步 RT-PCR 方法检测22-24
• 2.2.6.4 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果24
• 2.2.7 A549 细胞超氧化物歧化酶（SOD）蛋白的微板法检测24-26
• 2.2.7.1 总蛋白样本制备24
• 2.2.7.2 Lowery 法蛋白定量24-26
• 2.2.7.3 操作步骤26
• 2.2.7.4 计算公式26
• 2.2.8 A549 细胞培养上清中 NO 的检测26-27
• 2.3 统计学处理27
• 3 结果27-39
• 3.1 病毒半数感染量滴定27-28
• 3.2 RSV 感染 A549 细胞培养上清中 OH·的含量变化以及给予抗氧化剂和氧化剂干预后OH·含量的变化28
• 3.3 TLR3、NF-κB p65、IRF-3、SOD 在 RSV 感染组和 NAC，H_2O_2 干预组的 mRNA 转录水平的变化28-37
• 3.3.1 TLR3 mRNA 在各组不同时间点的表达29-31
• 3.3.2 NF-κB p65 mRNA 在各组不同时间点的表达31-33
• 3.3.3 IRF-3 mRNA 在各组不同时间点的表达33-35
• 3.3.4 SOD mRNA 在各组不同时间点的表达35-37
• 3.4 RSV 感染 A549 细胞上 SOD 活力的变化以及给予抗氧化剂和氧化剂干预后 SOD 的变化37-38
• 3.5 RSV 感染 A549 细胞培养上清中 NO 的含量变化以及给予抗氧化剂和氧化剂干预后 NO含量的变化38-39
• 4 讨论39-43
• 5 结论43
• 参考文献43-48
• 附录48-49
• 致谢49-50
• 综述50-58
• 参考文献55-58

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4 曾宪成;马t

本文编号：286158