PTD-Foxp3免疫功能的研究

发布时间：2020-11-09 23:27

　　 自然调节性T细胞(natural regulatory T cells, nTregs)调节生理及病理情况下机体的免疫应答,对于维持机体自身免疫耐受及免疫自稳具有重要作用。Foxp3在nTregs中高表达,是nTregs发生、发育及功能发挥必不可少的关键转录因子。同时Foxp3与其他T细胞如Th1、 Th17等的关键转录因子相互作用,与它们的分化发育存在密切的相关性,参与了临床各种免疫疾病的病理过程。 HIV-Tat蛋白转导结构域(protein transduction domains, PTD)能将外源性的生物分子带入细胞内,甚至核内,但对细胞无毒副作用,已广泛地应用于基础研究中,是生物医药重要的给药载体,为生命科学研究领域提供了新的工具。 目的：研究PTD-Foxp3融合蛋白的生物学功能,观察其对Tregs、Th17、Th1等亚群分化的调节作用及对免疫相关性疾病的治疗作用,为最终应用于临床器官移植及自身免疫病等免疫相关性疾病的治疗提供理论和实验室依据。 方法： (1)人淋巴瘤细胞系Jurkat或从外周血分离人PBMCs和CD4+CD25-T细胞,经融合蛋白PTD-人FOXP3(PTD-hFOXP3)处理后,分别采用CCK-8法检测(?)JCD4+CD25-T细胞活化增殖能力及蛋白转导的CD4+CD25T细胞对效应细胞的增殖抑制能力：RT-PCR检测IL-2、INF-γ、IL-10、IL-4、TGF-β和CTLA-4的mRNA表达水平；ELISA测定上清中IL-2、INF-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平及流式细胞术检测CD25和CTLA-4蛋白水平的表达；同时用CCK-8法检测(?)JPTD-hFOXP3对双向混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用；最后采用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测(?)JFOXP3在IL-2启动子区的富集情况； (2)体外观察融合蛋白PTD-小鼠Foxp3(PTD-mFoxp3)对小鼠Th1和Th17分化的调节。分离CD4+T细胞,经细胞因子诱导Th1、Thl7,加入PTD-mFoxp3处理,再采用定量PCR和流式细胞术分别检测INF-γ、T-bet、IL-17A、RORyt mRNA表达水平(?)(?)NF-γ、IL-17A(?)的蛋白表达水平变化来评价PTD-mFoxp3对这两种T细胞亚群分化的影响； (3)采用PTD-mFoxp3治疗OVA诱导的迟发性超敏反应(Delayed hypersensitivity reaction, DTH)模型小鼠局部,通过观察耳廓肿胀程度,组织切片的组织病理变化,脾细胞对OVA的应答能力,耳廓局部组织及引流淋巴结分泌INF-γ能力等指标来观察PTD-mFoxp3对Th1介导的DTH的治疗作用。 结果： (1) PTD-hFOXP3能明显抑制CD4+CD25-T细胞的活化增殖,且其转导的CD4+CD25-T细胞能抑制CD3/CD28抗体活化的CD4+CD25-效应T细胞增殖;RT-PCR\ELISA及FCM结果表明PTD-hFOXP3明显下调IL-2与IFN-γ的表达,而上调IL-4、IL-10、TGF-β和CTLA-4的表达；PTD-hFOXP3还能抑制双向MLR; ChIP结果显示FOXP3富集于IL-2启动子区； (2)体外在重组细胞因子及CD3/CD28抗体诱导条件下,CD4+T细胞可以向Th1、Th17方向分化；在Th1极化条件下,经PTD-mFoxp3处理后,IFN-γ与T-bet mRNA表达水平明显下降,流式细胞术结果显示IFN-γ+CD4+T细胞比率也明显降低；在Th17极化条件下,PTD-mFoxp3能下调IL-17A与RORyt的mRNA表达水平及IL-17A的蛋白表达水平； (3)耳局部给予PTD-mFoxp3治疗DTH模型小鼠,可以明显减轻耳廓的肿胀程度,改善耳廓局部组织炎症情况；耳局部引流淋巴结细胞分泌IFN-γ水平降低,而Foxp3表达水平上调。 结论：PTD-hFOXP3可以将CD4+CD25T细胞转化为Treg样细胞；PTD-mFoxp3抑制了CD4+T细胞体外向Th1、Th17方向分化,且可有效抑制小鼠DTH的发生发展,因止(?)PTD-hFOXP3/mFoxp3对Th1和Th17细胞亚群的分化具有负向调控作用,为最终PTD-FOXP3应用于移植排斥和自身免疫病等临床疾病的治疗提供了实验基础。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R392
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）
        1.1.1 调节性T细胞的分类
+CD25⁺调节性T细胞特点及功能'>        1.1.2 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞特点及功能
+CD25⁺调节性T细胞与临床疾病'>        1.1.3 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞与临床疾病
+CD25⁺调节性T细胞体外诱导扩增'>        1.1.4 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞体外诱导扩增
    1.2 Foxp3
        1.2.1 Fox家族与Foxp3
        1.2.2 Foxp3与Tregs
        1.2.3 Foxp3、RORγt和Tregs与Th17的平衡
        1.2.4 Foxp3和Th1
    1.3 PTD简介
        1.3.1 蛋白转导域的来源与TAT-PTD结构特点
        1.3.2 PTD作用特点及机制
        1.3.3 PTD的应用
第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法及实验设计方案
    2.3 本研究的意义
+CD25^-T细胞为Treg样细胞'>第三章 PTD-hFOXP3诱导CD4⁺CD25^-T细胞为Treg样细胞
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验菌株和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 主要溶液
    3.2 方法
        3.2.1 pET28a-PTD-hFOXP3,pET28a-hFOXP3和pET28a-PTD-eGFP融合蛋白的制备
            3.2.1.1 Rosetta感受态的制备
            3.2.1.2 重组质粒转化
            3.2.1.3 融合蛋白的诱导表达
            3.2.1.4 融合蛋白的纯化
            3.2.1.5 融合蛋白的脱盐
            3.2.1.6 融合蛋白去内毒素
            3.2.1.7 融合蛋白的SDS-PAGE电泳
        3.2.2 PTD-hFOXP3的细胞增殖抑制实验
            3.2.2.1 外周血单个核细胞（PBMC）的分离
+T,CD4⁺CD25^-T,CD4⁺CD25⁺T细胞'>            3.2.2.2 磁珠法分离人CD4⁺T,CD4⁺CD25^-T,CD4⁺CD25⁺T细胞
            3.2.2.3 刺激剂浓度的确定
            3.2.2.4 细胞增殖抑制试验
+CD25^-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4 mRNA表达水平的检测'>        3.2.3 CD4⁺CD25^-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4 mRNA表达水平的检测
            3.2.3.1 标准质粒的构建
            3.2.3.2 定量PCR标准曲线的绘制
+CD25^-T细胞活化不同时间的细胞因子分泌谱'>            3.2.3.3 CD4⁺CD25^-T细胞活化不同时间的细胞因子分泌谱
+CD25^-T细胞的细胞因子及CTLA-4mRNA表达水平的作用'>            3.2.3.4 PTD-hFOXP3对CD4⁺CD25^-T细胞的细胞因子及CTLA-4mRNA表达水平的作用
+CD25^T细胞的CTLA-4蛋白水平的检测'>        3.2.4 PBMCs分泌的细胞因子及CD4⁺CD25^T细胞的CTLA-4蛋白水平的检测
            3.2.4.1 标本的收集
            3.2.4.2 ELISA检测标本
            3.2.4.3 Flow cytomctry检测CTLA-4蛋白水平的检测
+CD25^-T细胞的免疫抑制实验'>        3.2.5 PTD-hFOXP3转导的CD4⁺CD25^-T细胞的免疫抑制实验
        3.2.6 双向混合淋巴细胞反应（MLR）
        3.2.7 染色质免疫共沉淀（ChIP）
        3.2.8 统计学处理
    3.3 实验结果
        3.3.1 成功制备PTD-hFOXP3、hFOXP3和PTD-eGFP融合蛋白
        3.3.2 确定T细胞活化条件
+CD25^-T细胞的增殖'>        3.3.3 PTD-hFOXP3抑制活化CD4⁺CD25^-T细胞的增殖
+CD25^-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4表达的影响'>        3.3.4 PTD-hFOXP3对CD4⁺CD25^-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4表达的影响
            3.3.4.1 标准质粒的构建
+CD25^-T细胞活化不同时间细胞因子及CTLA-4表达情况'>            3.3.4.2 CD4⁺CD25^-T细胞活化不同时间细胞因子及CTLA-4表达情况
+CD25^-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影响'>            3.3.4.3 融合蛋白对CD4⁺CD25^-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影响
            3.3.4.4 ELISA检测融合蛋白对PBMC分泌的细胞因子在蛋白水平上的影响
            3.3.4.5 Flow cytometry检测CTLA-4蛋白水平的检测
+CD25^-T细胞对效应细胞的增殖抑制作用'>        3.3.5 PTD-hFOXP3转导的CD4⁺CD25^-T细胞对效应细胞的增殖抑制作用
        3.3.6 PTD-hFOXP3抑制双向混合淋巴细胞反应（MLR）
+CD25^-T细胞的IL-2启动子而下调其表达'>        3.3.7 PTD-hFOXP3能够直接结合CD4⁺CD25^-T细胞的IL-2启动子而下调其表达
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 PTD-mFoxp3对Th17、Th1体外分化的影响
    4.1 材料
        4.1.1 实验菌株和质粒
        4.1.2 主要试剂及仪器
    4.2 方法
        4.2.1 PTD-mFoxp3与mFoxp3融合蛋白的制备
+T细胞'>        4.2.2 磁珠法分离小鼠CD4⁺T细胞
            4.2.2.1 准备工作
            4.2.2.2 洗磁珠
+T细胞'>            4.2.2.3 阴性分选小鼠CD4⁺T细胞
        4.2.3 体外诱导鼠Th17的分化
        4.2.4 定量PCR检测mouse IL-17A和mouse RORγt在mRNA水平的表达
        4.2.5 流式细胞术检测胞内mouse IL-17A的表达
        4.2.6 ELISA方法检测mouse IL-17A的表达
        4.2.7 PTD-mFoxp3对鼠Th1体外分化的影响
        4.2.8 统计学处理
    4.3 实验结果
        4.3.1 成功制备PTD-mFoxp3与mFoxp3融合蛋白
        4.3.2 鼠IL-17A和RORγt标准质粒的构建
        4.3.3 鼠Th17体外分化条件的摸索
        4.3.4 定量PCR检测PTD-mFoxp3对IL-17A和RORγt mRNA表达水平的影响
        4.3.5 流式细胞术检测PTD-mFoxp3对IL-17A蛋白表达变化的影响
        4.3.6 ELISA检测PTD-mFoxp3对IL-17A蛋白表达变化的影响
        4.3.7 鼠IFN-γ和T-bet标准质粒的构建
        4.3.8 PTD-mFoxp3对IFN-γ和T-bet mRNA表达水平的影响
        4.3.9 PTD-mFoxp3对IFN-γ和T-bet蛋白水平的影响
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 PTD-mFoxp3对小鼠迟发型超敏反应的治疗作用及其初步机制研究
    5.1 材料
        5.1.1 主要试剂及仪器
        5.1.2 实验动物
    5.2 方法
        5.2.1 DTH模型的建立
        5.2.2 PTD-mFoxp3的治疗
        5.2.3 观测指标
            5.2.3.1 小鼠一般情况
            5.2.3.2 小鼠耳廓肿胀程度
            5.2.3.3 小鼠耳片重量差
            5.2.3.4 胸腺指数和脾脏指数
            5.2.3.5 小鼠耳廓局部组织变化
            5.2.3.6 小鼠脾脏细胞的增殖活性
            5.2.3.7 耳引流淋巴结中Tregs和Th1细胞的分布
            5.2.3.8 耳片组织中IFN-γ与T-bet的表达
            5.2.3.9 淋巴结细胞与脾细胞培养上清IFN-γ的检测
        5.2.4 统计学处理
    5.3 实验结果
        5.3.1 成功复制了DTH模型
        5.3.2 PTD-mFoxp3对DTH小鼠的治疗作用
    5.4 讨论
    5.5 小结
第六章 主要结论及展望
    6.1 主要结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
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