胎牛视网膜干细胞分离培养、生物学鉴定及松萝酸对其生长影响的研究

发布时间：2017-04-06 12:11

  本文关键词：胎牛视网膜干细胞分离培养、生物学鉴定及松萝酸对其生长影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：视网膜色素变性，年龄相关性黄斑变性，青光眼视神经萎缩，视网膜钝挫伤等眼科疾病在逐渐威胁着人类的健康，现代科学可通过体外分离培养视网膜干细胞，诱导分化成视网膜损伤成分，然后进行体内移植，替换其损伤成分，从而重建视网膜结构的研究。松萝酸作为我国的新型靶细胞治疗药物，其对干细胞治疗前景有待考究。利用松萝酸药物处理视网膜干细胞很有希望成为治疗眼疾的一条辅助的途径，为我们最终有效的治疗这些眼病，恢复患者的视功能提供了新的思路。 本研究采用机械吹打法从胎牛眼球睫状缘部分分离视网膜干细胞（Retinal stemcells, RSCs），并对其生物学特性进行研究，通过免疫荧光和RT-PCR方法鉴定RSCs标志物Nestin、Chx-10和Pax-6，并使用在培养基中添加胎牛血清法定向诱导其向星形胶质细胞、神经元细胞及少突胶质细胞诱导分化，检测其多向分化潜能。并以分离培养的视网膜干细胞为研究对象，采用悬浮培养法进行细胞培养，研究了不同浓度的松萝酸药物处理RSCs进而观察对其生长影响及其相关生物学机制。经倒置显微镜观察细胞形态；透射电镜观察细胞结构变化；RT-PCR检测不同浓度的松萝酸作用RSCs前后bax、bcl-2、Fas和caspase基因mRNA表达水平的变化。 结果表明： 1.采用机械分离法获得的视网膜干细胞，无血清悬浮培养传至第10代，获得了大量纯度较高的视网膜干细胞。 2.阐明了视网膜干细胞体外生长规律，，并绘制了生长曲线，细胞生长曲线呈“S”型。 3.对视网膜干细胞进行了核型检测，结果显示其二倍体染色体数目为2n=60，包括1对性染色体和29对常染色体，性染色体为X、Y，雄性为同配XY，雌性为异配XX。 4.对获得的细胞进行了鉴定，免疫荧光鉴定结果为视网膜干细胞能够表达Nestin神经干细胞特异性基因，以及视网膜细胞特异性标志物Pax-6及Chx-10。RT-PCR结果为Sox2，nestin,Six6,Pax6均呈阳性表达。 5.对细胞进行了体外诱导分化的研究，采用血清诱导法成功将视网膜干细胞诱导为星形胶质细胞、神经元细胞及少突胶质细胞，且特异性基因均呈阳性表达。 6.不同浓度的松萝酸对视网膜干细胞进行药物作用，形态学观察结果显示，细胞悬浮生长，呈圆形，折光性好，细胞胞体小而核较大，细胞表面光滑，无明显凸起。 7.经松萝酸处理后的视网膜干细胞经透射电镜观察。细胞胞质丰满均一，核大胞浆少，核仁清晰，核膜完整，胞内各细胞器也无明显变化。 8.经RT-PCR检测松萝酸凋亡处理后的视网膜干细胞，其凋亡基因bcl-2、bax、Fas和caspase结果均呈阴性表达，说明松萝酸对视网膜干细胞作用前后均无明显变化。
【关键词】：地衣 松萝酸 胎牛 视网膜 干细胞 体外培养
【学位授予单位】：齐齐哈尔大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1 前言12-18
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 松萝植物简介13-14
• 1.2.1 松萝酸的抗菌作用13
• 1.2.2 松萝酸的抗氧化作用13-14
• 1.2.3 松萝酸的抗辐射作用14
• 1.2.4 松萝酸的其他作用14
• 1.3 神经干细胞的概述14-15
• 1.4 视网膜干细胞概述15
• 1.5 p53 基因15-16
• 1.6 bcl 2 基因家族16
• 1.7 Fas 基因家族16
• 1.8 本研究的目的、意义和选题依据16-18
• 2 材料与方法18-30
• 2.1 试验材料与仪器18-19
• 2.1.1 试验材料18
• 2.1.2 主要仪器设备18
• 2.1.3 主要试剂18-19
• 2.1.4 主要试剂的配制19
• （一）细胞培养试剂配制19-21
• （二）生长曲线试剂配制20
• （三）免疫组化检测试剂配制20-21
• （四）细胞系核型分析试剂配制21
• 2.2 方法21-30
• 2.2.1 视网膜干细胞的分离培养21
• 2.2.2 视网膜干细胞的传代与冻存21-22
• 2.2.3 视网膜干细胞生长曲线绘制22
• 2.2.4. 核型分析22
• 2.2.5 视网膜干细胞的鉴定22-25
• （一）免疫荧光检测表面标记22-23
• （二） RT PCR 检测表面标记23-25
• 1.细胞 total RNA 提取23
• 2.甲醛变性电泳判断 RNA 完整性23-24
• 3.cDNA 的合成24
• 4.PCR 反应24-25
• 2.2.6 视网膜干细胞的诱导分化及鉴定25-27
• （一）视网膜干细胞向星形胶质细胞诱导分化25-26
• （二）视网膜干细胞向神经元诱导分化26
• （三）视网膜干细胞向少突胶质细胞诱导分化26-27
• 2.2.7 药物处理27
• 2.2.8 药物处理后形态学观察27
• 2.2.9 透射电镜观察细胞形态结构的变化27-28
• 2.2.10 RT PCR 检测细胞凋亡相关基因的变化28-30
• 3 结果30-42
• 3.1 视网膜干细胞形态学观察及冻存复苏结果30-31
• 3.2 视网膜干细胞生长曲线的绘制31-32
• 3.3 视网膜干细胞核型分析32-33
• 3.4 视网膜干细胞的鉴定33-36
• 3.4.1 免疫荧光检测表面标记33-35
• 3.4.2 RT PCR 检测表面标记35-36
• 3.5 视网膜干细胞的诱导分化及鉴定36-38
• 3.6 药物处理后形态学观察38-39
• 3.7 透射电镜观察细胞形态结构的变化39-40
• 3.8 RT PCR 检测细胞凋亡相关基因的变化40-42
• 4 讨论42-45
• 4.1 视网膜干细胞的分离与培养及生长曲线测定42
• 4.2 视网膜干细胞的核型检测42-43
• 4.3 视网膜干细胞的鉴定43
• 4.4 视网膜干细胞的定向诱导分化及鉴定43
• 4.5 松萝酸处理后形态学观察43-44
• 4.6 透射电镜观察细胞形态结构的变化44
• 4.7 RT PCR 检测凋亡基因的表达44-45
• 结论45-46
• 参考文献46-51
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况51-52
• 致谢52-53

【参考文献】

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本文编号：288848