红景天苷通过抑制ROS-NO通路对MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的神经保护作用

发布时间：2017-04-06 12:14

  本文关键词：红景天苷通过抑制ROS-NO通路对MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的神经保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种好发于中老年人的中枢神经系统变性疾病，其特征性病理变化是中脑炓质致密部(substantia nigra pars compact，SNpc)含黑色素的多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性缺失，残存的神经元胞质内出现以聚集化的α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）为主要成分的嗜酸性包涵体，即路易小体（Lewy body，LB），其发病机制尚不十分明确，可能与氧化应激、线粒体功能障碍和蛋白质的错误折叠等有关。 1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyrid-ine，MPTP）是人工合成毒品的副产物，1-甲基-4苯基吡啶离子（1-methy-4-phenylpyridinium，MPP+）是其活性代谢产物，MPP+可以选择性抑制线粒体复合物Ⅰ，诱导氧化应激，导致细胞死亡。MPTP诱导的C57BL/6小鼠是目前学术界广泛运用并得到公认的研究PD的经典模型之一。 目前，PD的治疗主要为以左旋多巴制剂为主的替代疗法，但该方法仅能缓解临床症状，并不能阻止或延缓PD的进程，同时长期使用该法也存在疗效衰减及运动障碍等副作用。近年来，植物药的研究在一定程度上引起了一些学者的关注和兴趣。 红景天是一种传统的中草药，对衰老相关的疾病具有一定的治疗作用。红景天苷（Salidroside，Sal），又名2，4-羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是红景天的主要活性成分之一。大量体内外实验研究表明，Sal具有抗氧化、抗衰老、抗增殖和抗癌等作用。研究发现Sal对谷氨酸诱导的海马神经元的损伤具有保护作用，并对过氧化氢、低血糖等诱导的PC12细胞和SH-SY5Y细胞凋亡模型具有抗凋亡作用。我们以前的研究发现，Sal对MPP+诱导的PC12细胞的凋亡有一定的抑制作用，其机制可能与NO通路有关。为了进一步研究Sal的神经保护作用，本研究选择MPTP诱导的C57BL/6小鼠作为PD模型，观察Sal对MPTP诱导的PD模型小鼠的影响，体内验证Sal是否通过调节ROS-NO通路对MPTP诱导的PD小鼠发挥神经保护作用。 【目的】 1．建立MPTP诱导的PD模型小鼠模型。 2．观察Sal对MPTP诱导的PD模型小鼠行为学、形态学及生化方面的影响。 3．探讨Sal是否通过调节ROS-NO通路对MPTP诱导的PD模型小鼠发挥神经 保护作用。 【方法】 1.实验动物的分组与造模：根据随机数值表将实验动物（由第四军医大学实验动物中心提供）随机分为6组，每组20只。a组：正常组，腹腔注射生理盐水0.3ml/次，1次/d，连续14d；b组：模型组，腹腔注射MPTP （购于Sigma，生理盐水溶）30mg/kg，1次/d，连续7d，7d后腹腔注射等体积生理盐水，1次/d，连续7d；c组和d组为Sal干预组，腹腔注射MPTP30mg/kg，1h后分别给予Sal（购于北京华迈科生物技术有限责任公司，纯度98%）15mg/kg或45mg/kg，1次/d，连续7d，随后7d停止注射MPTP，只给予腹腔注射Sal15mg/kg或45mg/kg。e组和f组，单纯给予Sal (15mg/kg)或(45mg/kg)腹腔注射，1次/d，连续14d。每次给药后观察小鼠的行为学变化，判断小鼠造模是否成功。实验过程中对动物的饲养及取材均遵守第四军医大学实验动物管理和保护的有关规定。给药第二周开始用爬杆实验和悬挂实验观察小鼠行为学变化。 2.行为学检测完毕后第二天，每组随机选取6只小鼠灌注取脑制作冰冻切片，采用免疫荧光组织化学方法观察Sal对MPTP诱导的PD小鼠SNpc的TH阳性细胞和多巴胺转运体(Dopamine transporter，DAT)阳性神经元数目的影响。 3.全波段自动酶标仪检测ROS和NO水平。 4. Elisa试剂盒检测3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)蛋白含量。 5. Western Blot检测iNOS和nNOS蛋白的表达。 6.全自动酶标仪检测MDA的水平和GSH、GSH-Px、SOD的活性。 7.高效液相色谱法检测纹状体中DA、DOPAC和5-HT的含量。 【结果】 1.行为学检测结果：在爬杆实验中，MPTP模型组小鼠运动协调能力明显下降，与空白对照组组小鼠相比有显著性差异，表现为爬杆时间明显增加（P 0.01）。在给予不同剂量的Sal后，小鼠的运动协调能力明显改善爬杆时间缩短，且呈剂量依赖性（P 0.05，P 0.01）。悬挂实验中，模型组小鼠肢体协调能力与空白对照组相比明显下降(P0.01)，表现为其后肢均不能抓住细线，容易掉下。给予不同剂量的Sal (15，45mg/kg)干预后，悬挂能力不同程度增强(P0.05，P0.01)。 2.免疫荧光染色结果：在光镜下可见模型组小鼠黑质内TH阳性细胞的数量明显较空白对照组减少，给予不同浓度Sal干预后，，TH阳性细胞数目的减少得到缓解。统计学结果表明：与空白对照组（71.3±2.11）相比，模型组小鼠TH阳性细胞数目明显减少到（22.1±2.74）(P0.01)。与模型组相比，低剂量(15mg/kg)的Sal干预组为（37.7±1.87）（P 0.05），高剂量Sal (45mg/kg)的干预组TH阳性细胞为（62.1±1.53）(P0.01)。单纯Sal组与空白对照组相比无统计学意义。 在光镜下可见模型组小鼠黑质内DAT阳性神经元的数量明显较空白对照组减少，给予不同浓度Sal干预后，DAT阳性神经元数目的减少得到缓解。对以上结果进行统计学分析表明，与空白对照组（64.4±1.76）相比，模型组DAT阳性神经元减少为（21.5±2.11）（P 0.01）。与模型组相比，低剂量（15mg/kg）Sal干预组为（37.6±2.13）（P 0.05），高剂量（45mg/kg）Sal干预组为（59.3±1.74）（P 0.01）。单纯Sal组与空白对照组相比无统计学意义。 3.全波段自动荧光酶标仪检测ROS和NO结果：与空白对照组内ROS水平(107.4±2.1)%相比，模型组内ROS水平增加到(269.3±2.7)%(P0.01)。不同剂量Sal (15和45mg/kg)干预后，与模型组相比， ROS水平明显下降，其值分别为(224.6±3.3)%(P0.05)和(154.7±3.4)%(P0.01)。单独Sal组内ROS水平分别为(105.3±2.0)%和（103.2±3.1）%。 与空白对照组内NO水平(99.3±2.9)%相比，模型组内NO水平增加到(179.6±3.3)%(P0.01)。不同剂量Sal (15和45mg/kg)干预后，NO水平分别下降为(154.1±3.7)%(P0.05)和(133.1±4.1)%(P0.01)。单独Sal处理组NO水平为(97.8±3.6)%和（95.4±2.9）%。 4. Elisa试剂盒检测结果：空白对照组内3-NT含量为(0.7±1.1)%，模型组内3-NT含量增加到(3.1±1.7)%(P0.01)。不同剂量Sal (15和45mg/kg)干预后，3-NT含量则分别下降为(2.7±1.6)%(P0.05)和(1.5±2.4)%(P0.01)。单独Sal组内3-NT含量为（0.7±0.3）%和(0.6±0.4)%。 5. Western Blot方法检测结果：Sal（15和45mg/kg）干预组和单纯Sal组iNOS和nNOS表达水平较模型组依次减弱。 6.全波段自动酶标仪检测MDA水平：与空白对照组(9.7±2.1)%相比，模型组MDA含量明显升高(21.3±2.7)%(P0.01)，不同剂量Sal (15和45mg/kg)干预后，MDA含量剂量依赖性降低(17.1±2.2)%(P0.05)和(13.6±2.8)%(P0.01)，单纯Sal组与空白对照组相比无统计学意义。 GSH含量和GSH-Px、SOD活性检测结果：与空白对照组相比，GSH含量和GSH-Px、SOD活性明显降低(P0.01)，不同剂量Sal (15和45mg/kg)干预后，GSH含量和GSH-Px、SOD活性剂量依赖性升高(P0.05，P0.01)，单纯Sal组与空白对照组相比无统计学意义。 7.高效液相色谱结果：模型组内DA、DOPAC和5-HT较空白对照组相比，含量明显下降(P0.01)，在给予不同剂量Sal (15和45mg/kg)干预后，含量剂量依赖性上升(P0.05，P0.01)。单纯Sal组与空白对照组相比无统计学意义。 【结论】 1. Sal对MPTP诱导的PD模型小鼠具有神经保护作用。 2. Sal可能通过抑制ROS-NO通路发挥对MPTP诱导的PD模型小鼠模型的神经保护作用。
【关键词】：帕金森病 MPTP 红景天苷 神经保护 小鼠 ROS NO 3-NT nNOS iNOS DA DOPAC 5-HT
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R742.5;R-332
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-33
• 实验一 红景天苷对 MPTP 诱导的帕金森病小鼠模型的神经保护作用33-39
• 1 材料33-34
• 2 方法34-36
• 3 结果36-37
• 4 讨论37-39
• 实验二 红景天苷对 MPTP 诱导的帕金森病小鼠模型神经保护作用机制的探讨39-53
• 1 材料39-40
• 2 方法40-50
• 3 结果50-51
• 4 讨论51-53
• 小结53-54
• 参考文献54-83
• 附录83-89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王文武;何建成;;帕金森病的中医文献研究[J];新中医;2008年01期

  本文关键词：红景天苷通过抑制ROS-NO通路对MPTP诱导的帕金森病小鼠模型的神经保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：288863